家蚕耐氟近等基因系SSH文库的构建及部分差异表达基因的分析

为了获取与家蚕耐氟性状相关的基因信息,利用家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种733新建立耐氟近等基因系,以回交11代的家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体的中肠为材料,构建家蚕耐氟近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对抑制消减杂交cDNA文库中随机挑选的153个阳性克隆测序和聚类拼接,得到19个重叠群(con-tig)、47个已知功能基因(un igene)和28个未知功能基因。获得的表达序列标签(EST)经BLASTx比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内物质转运、能量代谢、基因转录、蛋白质合成与降解、蛋白质加工、信号转导、机体免疫防御、细胞结构形成等诸多生物学过程。采用实时定量RT-PCR方法,对部分基因在家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体的不同组织的表达进行定量分析,发现磷酸根离子转运蛋白基因、三磷酸腺苷(ATP)合成酶基因、液胞型H+-ATP酶基因、脂肪酶基因以及主要过敏原蛋白基因在耐氟个体的中肠、马氏管、脂肪体组织中的表达量有较明显上调。     

藏鸡NSTN基因克隆与mRNA组织表达谱分析

肌肉生长抑制素(MSTN)是骨骼肌发育的负性调控因子,本研究用RT-PCR方法克隆藏鸡MSTN编码基因,用半定量RT-PCR方法检测MSTN mRNA在藏鸡腿肌等10个组织的表达情况.结果显示,藏鸡MSTN DNA长1128 bp,编码375个氨基酸.藏鸡与原鸡氨基酸序列一致率为99.7％,有6个同义突变和1个非同义突变的氨基酸差异.MSTN mRNA在腿肌、胸肌、心脏、肾脏、睾丸、卵巢、胃中均检测到表达,脂肪、肝脏、肺中未检测到MSTN mRNA表达.MSTN mRNA表达水平由高到低的顺序为:腿肌、胸肌、心脏、肾脏、睾丸、卵巢和胃.     

大白菜叶片总RNA提取方法的研究

利用不同浓度的水杨酸溶液处理苗龄为7 d的大白菜植株,在处理12 h后提取粗酶液并测定酶活.分别采用Trizol试剂法、改良SDS法、异硫氰酸胍法等方法对酶活力最高试验组的叶片提取RNA进行RT-PCR反应.结果表明,0.6 mmol·L-1水杨酸浓度诱导试验组效果最佳,几丁质酶的活力达到最大值;改良SDS法提取的大白菜叶片总RNA完整性好、纯度高, 提取的RNA可用于RT-PCR及RACE等实验操作.     

胡麻异质型ACCase亚基基因的克隆与表达分析

为研究胡麻异质型乙酰辅酶A羧化酶BCCP、BC、α-CT和β-CT四个亚基基因的生物学功能,采用基因克隆、生物信息学和RT-PCR技术分别对胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因进行分析。结果发现陇亚10号accA基因编码α-CT亚基,CDS序列全长为2364 bp,编码787个氨基酸;accB基因编码BCCP亚基,CDS序列全长为1173 bp,编码275个氨基酸;accC基因编码BC亚基,CDS序列全长为1574 bp,编码527个氨基酸;accD基因编码β-CT亚基,CDS序列全长为1137 bp,编码378个氨基酸,且4个基因编码的蛋白都是脂肪酸系数较高的亲水性蛋白。RT-PCR结果表明,胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因在3个胡麻品种(高含油量的张亚2号、中含油量的陇亚10号和低含油量的R2-17)的不同时期不同组织的表达模式不同,accA、accB、accC和accD四个基因在R2-17、陇亚10号和张亚2号3个胡麻品种所有时期的不同组织中均有表达,但在种子中的表达量均明显高于其他组织,尤其在种子发育10~25 d油脂快速积累时期,4个基因的表达量都迅速增加并达到最高峰。研究表明异质型乙酰辅酶A羧化酶基因可能调控胡麻种子发育前期油脂的合成积累。     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。     

一种快速简便的茶儿茶素高效液相色谱定量分析方法

采用茶样沸水浴浸提20min,SEP-PAK C18小柱净化试样的前处理方法和μBondapak C_(18)不锈钢柱,二甲基甲酰胺、甲醇、醋酸、水作流动相,流量、浓度线性梯度洗脱,柱温30℃等色谱条件,能使儿茶素组分在25min内得到理想分离。与前人研究结果比较,分辨率提高,分析时间缩短,稳定性好,灵敏度高,对于大量样品的分析有很好的适应性。     

犬冠状病毒RT—PCR检测方法的建立和初步应用

根据Ｗｅｓｅｌｉｎｇ发表的犬冠状病毒（ＣＣＶ）Ｋ３７８株纤突蛋白（Ｓ）基因序列，设计合成了４条寡聚核苷酸引物Ｐ１（１８ｂｐ，１５２０～１５３７ｂｐ）、Ｐ２（１９ｂｐ，２０７２～２０９０ｂｐ）和Ｐ３（２０ｂｐ，２６２１～２６４０ｂｐ）、Ｐ４（２０ｂｐ，２９４４～２９６３ｂｐ）。以此为引物，以从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株反转录产物为模板，在国内首先建立了ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ方法，并初步应用于国内ＣＣＶ分离株的鉴定。结果表明，以Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４为引物，只能从ＣＣＶＮＬ－１８株反转录产物中扩增出大小分别为５７１ｂｐ和３４３ｂｐ核苷酸片段，与理论设计值大小一致，而正常ＣＲＦＫ细胞和狂犬病等５种对照病毒扩增结果为阴性。ＲＴ－ＰＣＲ可检出１μＬ做１０５和１０３倍稀释的ＣＣＶＮＬ－１８株反转录产物，说明其具有很高的敏感性。初步应用试验结果，可从２株国内分离的ＣＣＶ反转录产物中扩增出５７１ｂｐ和３４３ｂｐ核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感、特异的ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ检测方法，也为其Ｓ基因的克隆和序列测定奠定了基础。     

侵染百合的李属坏死环斑病毒病（PNRSV）的研究

 【目的】在分子水平上鉴定百合上发生的李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）【方法】对待测百合种球随机抽样，在温室内种植并观察，长出叶片后，用RNA Extraction Kit (Sangon, China)从幼嫩的叶组织中提取核酸，将反转录出的cDNA用 PNRSV的特异性引物进行PCR扩增，电泳PCR产物得到了450bp的目的片段。低熔点胶回收并克隆至pGEM-T-easy载体测序后进行序列比对分析。【结果】 从百合中所扩增的450bpcDNA的核苷酸序列与27个早期已报道的PNRSV分离物的CP 基因的同源性为84.5%～99.1%。【结论】百合是PNRSV的一新寄主。     

应用RT-PCR技术快速检测鉴定猪瘟病毒

根据所有已报道的猪瘟病毒株（HCV）和牛病毒性腹泻病毒株（BVDV）的序列设计了3条引物Pa,Pb,Pc。应用RT-PCR技术，引物对Pa/Pb从猪瘟HCLV株，猪瘟Thiveral株，3株猪瘟野毒株都扩增出了预期185bp的片断，Pa/Pc从BVDVOregonC24V株中也扩增出了240bp的片断，而Pa/Pb与牛睾九原代细胞，PK-15细胞，BVDVOregonC24V株均无反应，Pa/Pc也不与所试验的5株猪瘟毒株反应。采用多重PCR可以从同时含有HCV和BVDV核酸的样品中扩增出各自的特异性条带。针对猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的特异性插入序列。设计了引物Pr,Pra,Prb，可以从HCLV细胞毒或用HCLV人工感染的兔脾组织毒中扩增出预期200bp的片断，而Pr,Pra,Prb与猪瘟Thiveral株和3株猪瘟野毒株均不反应，通过含毒量梯度试验，得出了RT-PCR可检测猪瘟病毒量的下限为200RID或200TCID50。     

PT-PCR方法在实验小鼠肝炎病毒检测中的应用

实验应用RT-PCR方法对来自不同单位、6个品系、不同等级的84只小鼠进行了MHV检测.结果显示:MHV阳性小鼠35只,阳性率为41.67%;其中普通级小鼠29只,阳性18只,阳性率为62.07%;SPF级小鼠55只,MHV阳性小鼠17只,阳性率为30.91%.