PCR技术在茶树害虫研究中的应用展望

聚合酶链式反应（PCR）是一种根据生物体内DNA复制的特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速扩增的新技术。随着重复多轮DNA合成技术的进步与具热稳定性的TaqDNA聚合酶的发现和应用，PCR技术不断完善，尤其是自动化PCR仪的设计成功，使PCR技术的操作程序大大简化，目前在分子生物学及其相关学科中已得到广泛应用，尤其在昆虫学研究中发展相当迅速。PCR技术可以应用到茶树害虫研究的许多方面，不久的将来，PCR技术也将成为我国茶树害虫研究的常用方法之一。     

安氏隐孢子虫ITS-1序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内三株安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)即GD株、HN株和AH株的rDNA的内转录间隔区Ⅰ(ITS_1)序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在确定ITS_1是否可作为C.andersoni分子分类的遗传标记。结果表明:GD株、HN株和AH株的ITS_1序列基本一致,仅AH株有三个碱基的差异;但与GenBank注册的C.muris和C.parvum存在种间差异,而且差异显著。说明ITS_1可作为C.andersoni种的遗传标记,从而为隐孢子虫属的种间鉴定以及进一步的分子流行病学调查和分子诊断学研究奠定了基础。     

改进的拟南芥CAPS标记方法

在模式植物拟南芥（Ambidopsis thaliana）的一种生态型Columbia（Col）中，存在大多数CAPS（切割扩增的多态性序列）标记的标记酶识别位点；而用于分析的酶中，只有37．5％～47．5％的酶在Col基因组的扩增区段存在酶识别位点，超过半数的酶在大多数CAPS标记的开发中无作用。因此，建立了一种改进的开发CAPS标记的方法。首先进行限制性内切酶分析，筛选出在Col基因组的扩增区段存在酶识别位点的候选酶，然后再在候选酶中筛选CAPS标记酶；只有在候选酶中找不到CAPS标记酶时，才在其它酶中筛选。应用实验结果表明，即使不知道拟南芥的另两种生态型Landsberg erecta（Let）和Cape Verde Islands（Cvi）的基因组序列，也可利用Col基因组序列开发Let和Cvi的CAPS标记，可节约超过500／0酶的费用。这种基于基因组的CAPS（geCAPS）方法在其它植物如水稻（Oryza sativa）和茶叶（Camellia sinensis）中的应用进行了讨论。     

不同类型免疫佐剂的作用比较

“免疫剂”(Immunoadjuvant)是一种能与特异性抗原结合 ,能比疫苗单独使用时产生更强的免疫应答的物质。免疫佐剂通常是指与抗原物质同时注射或预先注射后 ,能非特异地增强或改善动物机体对抗原物质免疫应答的物质。1　抗原传递系统佐剂1.1　弗氏佐剂　弗氏佐剂 (Freund′s Adju-vant,FA)分为弗氏完全佐剂 (FCA)和弗氏不完全佐剂 (FIA)。FCA是标准的诱生体液和细胞免疫佐剂 ,可诱导 Th1型细胞因子 ;FIA则是典型的只诱导 Th2型细胞因子 ,诱生抗体的佐剂。除少数兽用疫苗使用 FIA(如口蹄疫疫苗 )外 ,很少用于动物免疫。FCA的副作用 …     

禽劳斯肉瘤病毒群特异性抗原基因gp27片段的克隆及序列测定

以RT-PCR方法从人工感染禽劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)SR-RSV的SPF雏鸡体内及SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中分别扩增出720bp的gp27片段，将RT-PCR产物重组到质粒栽体pUCl9中，并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明，克隆片段为完整的目的基因，该片段的核苷酸序列与国外分离株RSV J02342的同源性达97．3％。     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术,从小鼠基因组中克隆了1.6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5′上游调控序列,经酶切和测序证实与已知序列基本一致.为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达,将此序列与报告基因CAT融合,构建了pWAP-CAT-polyA乳腺定位表达载体,脂质体包裹后,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达.分别于家兔分娩后1～10 d采奶,用ELISA检测乳汁中CAT含量.结果表明,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达,表达水平在家免分娩后1～5 d较高.     

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

六倍体小麦品种微卫星位点的序列变异

小麦微卫星XGWM261对小麦育种者是很有意义的，因为它与显著降低株高的基因（Rht8）是连锁的。早先的研究已表明在此XGWM261位点上存在3个主要的等位基因，并且大多数品种（90％）都是纯合的，因而形成了192、174或165bp的PCR产物。因为预先调查了澳大利亚小麦品种XGWM261位点上的杂合性和序列变异，所以我们用澳大利亚育种方案中24个重要的六倍体品种进行了克隆和PCR产物排序。     

伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

根据引物设计的一般原则，参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物，PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收：PCR产物，并将其克隆至pGEM—T Easy载体中，经酶切、PCR鉴定和序列分析，获得重组中间质粒pGEM／HGPRT。重组中间质粒pGEM／HGPRT经Nco I和Sal I双酶切，回收目的片段HGPRT，以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV／HGPRT，转化大肠杆菌DH5a，42℃诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析，表达产物HGPRT的分子量约为23kD，与理论推算值相符，表达率占总菌体蛋白的19％，经间接ELISA检测，表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。