文冠果实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)性别分化过程研究和不同器官的内参基因,本研究以文冠果性别分化关键期的顶芽和侧芽、根、茎、叶、种仁、雌能花和雄能花为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)鉴定7个候选内参基因(Actin,UBQ,EF-1α,TUB,eIF-4α,18S rRNA和GAPDH)在各样品中的表达量,并评价7个基因的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同样品中的表达量存在明显差异,各基因在雌能花中的表达均显著高于其他材料,在雄能花中的表达处于较低水平;适用于文冠果性别分化过程的最优内参基因为UBQ和eIF-4α,适用于不同器官的最优内参基因为EF-1α和GAPDH。研究结果将对今后进行文冠果性别分化过程研究和不同器官中的基因表达分析提供参考。     

狗头枣GSTU基因的克隆及其序列分析

为探索红枣GSTU类基因在红枣抗逆中的分子作用机制,本研究以狗头枣枣树叶片的DNA为模板,根据枣GSTU基因的序列(HM345954.1)设计引物,采用PCR方法获得GSTU基因序列,并利用生物信息学手段对其所对应蛋白的结构域、功能域、理化特性、跨膜区、二级结构及亚细胞定位等进行分析。结果表明:克隆到的DNA序列全长838 bp,具有2个外显子和1个内含子,内含子在292~460 bp碱基处,该序列与GenBank中枣的GSTU核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.85%和100%,表明成功的克隆了狗头枣的GSTU基因。该序列编码222个氨基酸,分子量为25.268 kD,理论等电点(pI)为6.10;亲水性的平均数为-0.242,表明该蛋白是亲水性蛋白。二级结构主要以α-螺旋为主,其次是无规则卷曲,不存在信号肽,表明该蛋白可能为非分泌性蛋白,该蛋白可能位于内质网(膜)和质膜上。本研究获得的狗头枣GSTU基因在基因结构上含有1个内含子,在核酸序列及氨基酸序列上与GenBank中枣的GSTU基因同源性高,并对其理化性质、结构等进行了预测与分析,为进一步研究红枣抗逆分子机制提供理论基础,同时为红枣品种的选育提供理论支持。     

乐都紫皮大蒜叶片生长发育与果聚糖代谢的关系

为了探讨高原大蒜生长特性及其果聚糖代谢规律,分析叶片生长发育与果聚糖代谢的关系,本研究以"乐都紫皮大蒜"为材料,对不同发育期的大蒜叶片生长情况、生理指标及其果聚糖代谢关键基因的表达特征进行了解析。结果表明:随着生育期的延续,大蒜植株的最大叶长、最大叶宽和单株叶片数均稳步增加。叶片生理指标呈现先升高后降低的趋势,总叶绿素含量在花芽分化之前快速上升,在抽薹期达到最大值2.32 mg/g FW;组织含水量在鳞茎膨大初期达到最大值89.06%,随后急剧降低。在整个发育过程中,大蒜叶片蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因(1-SST)和果聚糖外切水解酶基因(1-FEH)表达量存在显著差异,从幼苗期至鳞茎膨大初期,1-SST基因表达量显著高于1-FEH。1-SST的表达在全生育期表现为"升高-降低"的趋势,在抽薹期,1-SST的表达量达到峰值,比幼苗期提高了17.51倍;1-FEH在全生育期的表达量均较低,呈现起伏波动的趋势,在收获期表达量最高,是苗期的2.41倍。综合分析说明,大蒜叶片叶绿素和果聚糖的合成高峰主要在抽薹期,抽薹期是大蒜叶片生长发育和果聚糖代谢的关键时期,大蒜可通过叶绿素的合成以及1-SST和1-FEH的差异表达进一步影响鳞茎果聚糖的累积。     

马铃薯AP2/ERF转录因子的克隆及植物表达载体构建

AP2/ERF基因家族转录因子普遍存在于植物中,参与植物体内的各种生物学过程,包括植物的生长发育、生物和非生物胁迫响应等。前期转录组测序的结果发现马铃薯‘加湘1号’一个AP2/ERF家族基因(PGSC0003DMG400012154)在接种晚疫病菌(Phytophthora infestans)24 h后被显著激活。从接种P.infestans 24 h的‘加湘1号’的总RNA中通过RT-PCR获得了该基因CDS序列为885 bp,BLAST分析显示该基因编码一个295个氨基酸残基的蛋白,并且含有1个AP2/ERF结构域,是AP2/ERF转录因子家族中的ERF亚家族的一员。本研究将该基因与XcmⅠ酶切的表达载体pCXSN连接,转化大肠杆菌,通过测序挑选插入正确克隆酶切验证,并成功转化农杆菌。本研究结果为进一步研究该基因的功能提供了帮助。     

大白菜TPS基因家族鉴定及其在高温胁迫下的表达分析

为明确大白菜TPS(BrTPS)家族成员信息及对高温胁迫信号的响应,本研究利用生物信息学方法,在大白菜基因组数据库中鉴定了BrTPS基因家族成员,并对其理化性质、进化特征、蛋白结构及在高温胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,大白菜全基因组含有15个TPS基因家族成员,分布于8条染色体上。除BrTPS14和BrTPS15外,其余成员各含有1个TPS和1个TPP结构域,并且所含motif的排列顺序也完全一致。理化性质分析发现,15个成员的氨基酸长度介于129~1459 aa之间,分子量大小在14.73~165.83 kD之间,大部分BrTPS蛋白为酸性蛋白和亲水蛋白,以无规则卷曲作为二级结构主要构成元件。进化分析表明,大白菜TPS基因家族成员可分为2类,其中ClassⅠ包含5个成员,ClassⅡ包含10个成员。本研究对高温胁迫前后不同组织和持续高温胁迫下叶片中的表达分析,发现大部分的BrTPS基因可对高温胁迫产生响应,但在表达规律上存在差异。这些研究结果为后续研究大白菜TPS基因提供一定参考。     

甜玉米(Zea mays L.saccharata Sturt)含糖量与主要农艺性状的相关及通径分析

为选育含糖量高的甜玉米品种,本试验对甜玉米含糖量与主要农艺性状进行相关性分析。结果表明,含糖量与穗长、株高、穗位呈正相关,与单穗重、秃尖长、穗粗、穗行数、行粒数、轴重、轴粗、百粒重、茎粗呈负相关。在实际选择中可以参考这些性状来选择含糖量高的甜玉米。为了更加清楚地了解各主要农艺性状和含糖量之间的直接效应和间接效应,对此进行通径分析,结果表明,各农艺性状对含糖量的通径系数顺序为穗长>株高>轴重>穗位>单穗重>穗粗>茎粗>行粒数>穗行数>百粒重>轴粗>秃尖长>皮渣率。本研究为今后选育含糖量高的甜玉米品种提供了重要的参考依据。     

草鱼TAB1蛋白的原核重组表达及其抗体制备

为了制备草鱼重组TAB1蛋白(rCiTAB1)及其特异性抗体,首先以草鱼头肾组织c DNA为模板,PCR扩增Ci TAB1基因全长序列,并依次构建重组克隆质粒p MD19-T-Ci TAB1与重组表达质粒pET-32a-Ci TAB1。该重组表达质粒经0.5 mmol·L~(-1) IPTG,37℃诱导表达12 h后获得以包涵体形式表达的重组CiTAB1蛋白(rCiTAB1)。然后,采用3种不同方法对包涵体蛋白进行变性,发现与高浓度尿素直接变性法和洗涤后尿素变性法相比,洗涤后梯度尿素变性法处理后的蛋白纯度最好,经透析复性后得到浓度为2 mg·mL~(-1)的r Ci TAB1。最后,将rCiTAB1蛋白与白油佐剂及免疫增强剂混合,室温下混合1.5h乳化成免疫原,3次免疫新西兰大白兔制备兔抗CiTAB1抗体,经间接ELISA方法和免疫琼脂双向扩散试验测得免疫后第33天血清中特异性抗体的效价分别为1∶1 048 576和1∶16。Western blot检测到一条分子量约为72 kDa的特异性条带,表明该抗体能特异性识别r Ci TAB1蛋白。研究结果为后续深入研究CiTAB1蛋白功能提供了物质基础。     

围垦对滨海稻田土壤N2O还原潜力的影响

稻田湿地生态系统的N₂O还原消耗潜力对缓解大气温室气体效应具有重要意义,而滨海自然湿地围垦改造成稻田后耕层土壤的N₂O还原速率及其微生物机制却鲜有报道。选取崇明岛光滩湿地为对照（WK0）,比较研究不同围垦年限（19、27、51、86 a）的围垦区稻田耕作层土壤N₂O还原速率演替规律及其微生物数量变异特征。结果表明,土壤总有机碳含量（TOC）随围垦年限增长而显著增加,而土壤pH值、SO₄^2-浓度和EC值则均随围垦年限增长而呈逐渐下降趋势。土壤N₂O还原速率随围垦年限增长而显著增加,其中围垦86 a稻田土壤达到25.5 μg N₂O·g^-1·d^-1,与光滩湿地相比增加了58.4%。定量PCR结果发现,功能基因nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ拷贝数也随着围垦年限增长而显著增加,其中围垦86 a的稻田土壤功能基因分别为1.72×10⁸ copies·g^-1和4.36×10⁸ copies· g^-1,比光滩湿地稻田高出一个数量级。相关性分析发现土壤N₂O还原速率与功能基因nosZ Ⅰ拷贝数呈显著正相关,而功能基因nosZ Ⅱ拷贝数随围垦年限的增加率远高于功能基因nosZ Ⅰ;N₂O还原速率、功能基因nosZ Ⅰ、nosZ Ⅱ拷贝数与3个土壤理化指标（pH、EC、SO₄^2-）均呈负相关。因此,围垦造田促进了滨海湿地土壤N₂O还原过程,而功能基因nosZ Ⅰ数量的大幅增加是N₂O还原速率增加的重要原因。     

GDFs基因家族候选基因对崇仁麻鸡生长性状的影响

利用崇仁麻鸡差异性状的重测序结果,将生长分化因子(GDFs)基因家族作为候选基因,筛选与崇仁麻鸡生长性状相关的多态位点。结果发现,GDF-2、GDF-8和GDF-10基因的多态位点对崇仁麻鸡的生长性状有着显著或极显著的影响。单倍型分析结果显示,GDF-2和GDF-10基因的单倍型H3H3为劣势单倍型组合可以选择淘汰。研究结果表明,GDFs基因家族候选基因对崇仁麻鸡的生长性状有一定的影响。     

羊口疮病毒安徽株116基因的生物信息学分析及原核表达

为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因,使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体,经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序,构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导,纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示,ORFV116基因全长561 bp,编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa,为不稳定亲水性蛋白;无信号肽、保守结构域及跨膜结构域;含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点;二级结构以无规则卷曲为主,分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）;预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示,ORFV116蛋白大小约为51 kDa,主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。