利用cDNA-AFLP分析内生解淀粉芽胞杆菌 Fy11诱导辣椒差异表达基因

【目的】分析内生解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Fy11诱导辣椒（Capsicum annuum）幼苗差异表达基因,了解辣椒与内生芽胞杆菌互作的分子机制。【方法】利用cDNA-AFLP技术,采用256对引物,分析辣椒幼苗接种内生解淀粉芽胞杆菌Fy11后5个时间点的基因表达谱;利用qRT-PCR分析差异基因表达模式,验证cDNA-AFLP表达谱。【结果】256对引物共产生18 620个转录本（TDF）,筛选获得353条差异表达条带,占扩增条带总数的1.89%。经克隆、测序分析,最终获得257个差异TDF,聚类分析得到229个独立基因（EST,unigenes）,其中144个基因上调表达,85个基因下调表达。经Blastx比对和功能分类分析,其中65条EST（28.38%）未找到同源性匹配,8条（3.49%）与未知功能蛋白同源性较高。其余156条EST主要涉及基础代谢基因（10.92%）;与能量和抗病与防御类相关基因,各占8.73%;信号转导基因占7.42%;转运子或转座子基因占6.99%;与细胞结构相关基因占6.55%;参与转录调控基因占5.68%;细胞生长类基因占3.93%;参与蛋白质运输和储存有8个基因,占3.49%;蛋白质合成类基因占2.18%;次生代谢类和胞间运输类基因,其数量相对较少,各占1.75%。选取与抗病防御、转录调控及信号转导类等相关的10个差异基因,qRT-PCR分析结果显示其表达模式符合cDNA-AFLP表达谱。【结论】内生细菌与植物互作的分子机制涉及植物多方面生理生化反应,包括抗病防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、以及非生物胁迫等多种途径相关基因的协同控制。     

利用cDNA—AFL吩析辣椒细胞核雄性不育两用系的基因表达差异

[目的]为进一步了解辣椒不育性的分子遗传机理和雄配子的发育机制,对辣椒细胞核雄性不育的育性相关基因进行初步研究。[方法]利用eDNA—AFLP对辣椒细胞核雄性不育两用系‘AB23’的可育株花蕾和不育株花蕾的表达基因进行比较和分析。[结果]可育株与不育株在基因表达上存在差异,筛选出10对引物,并得到了有差异且重复性好且的19条TDFs,其中14条TDFs功能已知,3个功能未知,2个未找到同源序列。该研究通过RT—PCR技术对获得的19个TDFs进行验证,其表达特征与eDNA—AFLP结果一致。[结论]差异基因功能涉及细胞分泌、代谢、转录、细胞程序性死亡、蛋白质修饰、胞间运输、信号转导、细胞黏附等多个相关过程。     

甘蓝型油菜双主茎材料苗期抗旱相关基因的cDNA-AFLP差异显示

在云南本地芥菜型油菜文山大脚黄(母本)与甘蓝型油菜品种花油5号(父本)杂交F1小孢子培养获得的DH群体中分离出双主茎材料,其田间表现具有良好的抗旱性.利用cDNA-AFLP技术分析七叶期甘蓝型油菜双主茎材料在干旱和对照条件下基因差异表达情况.共筛选了512对引物组合,获得56个干旱诱导上调表达的差异片段.对36个大于100 bp的片段克隆测序、同源比对、结果归并为30个非重复的TDFs,对已知功能的18个TDFs功能预测表明这些片段参与了细胞形态建成与降解、代谢、能量、细胞周期、蛋白质合成、蛋白质修饰、蛋白质结合、运输途径等相关过程.本试验获得的差异表达基因对于了解油菜苗期抗旱性形成的调控机制具有一定的参考价值.     

橡胶树冷应答转录组cDNA-AFLP分析

以橡胶树11个抗寒无性系和12个不抗寒无性系为研究对象,利用cDNA-AFLP技术对23个橡胶树无性系低温处理前后的基因表达谱进行差异分析。结果表明:通过100对引物组合的扩增筛选,共获得12条在2组材料中表现一致的差异片段(GenBank登录号:GO269543-GO269554);BLASTn和BLASTx比对分析显示,TDF7-8,TDF5-15,TDF16-103条片段分别与植物抗逆相关的ABC转运蛋白、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS)、WRKY基因有较高相似性,其余9条片段在GenBank未比对到同源序列。     

白桦cDNA-AFLP体系的优化和建立

为了建立适合白桦的cDNA-AFLP体系,对反应体系中的酶切、预扩增、选择性扩增的引物筛选等几个重要的影响因素进行优化,得到了适合白桦的cDNA-AFLP反应体系。选择白桦雄花为研究材料,用改良的CTAB法提取总RNA,采用低频酶EcoRⅠ和高频酶MseⅠ酶切双链cDNA。通过研究发现,预扩增中Mg2+浓度为2mmol/L,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.25mmol/L,Taq酶浓度为1U,退火温度控制在60℃时,预扩增结果较好。另外,从16对引物组合中选出11对选择性较好的引物组合,扩增的产物经过6%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳和银染检测,得到清晰、分辨率高、信号强度明显且重复性好的结果,表明该cDNA-AFLP分析体系适用于白桦相关的功能基因的研究。     

大白菜育性相关基因BRLSP-55的获得与验证

雄性不育的利用是大白菜制种的重要手段,获得大量育性相关基因可为了解大白菜雄性不育分子机制提供线索。采用cDNA-AFLP技术寻找差异条带,利用RT-PCR经序列比对并推测其功能。利用cDNA-AFLP方法从大白菜雄性不育两用系“AB01”的不育和可育花蕾中找到一个仅在可育花蕾中表达,而在不育花蕾中不表达的差异片段;经测序分析表明所得序列大小为351 bp,将其命名为BRLSP-55;并通过RT-PCR方法得到了验证;经序列比对初步判定该基因与拟南芥硫堇蛋白(Thionin Protein)的亲缘关系较近,所获得育性相关基因BRLSP-55可能为一种硫堇蛋白,在大白菜雄性不育机制中可能起重要作用。     

Ht2背景下玉米对大斑病菌1号小种抗性基因的表达差异研究

以玉米自交系黄早四和黄早四Ht2近等基因型系为材料,利用cDNA-AFLP差异显示方法,分析玉米抗大斑病Ht2相关基因受大斑病菌1号小种胁迫后的差异表达情况。用筛选的70对引物在黄早四Ht2中扩增出76个差异显示片段,对差异条带回收、克隆和测序,并在NCBI上进行BLAST分析,有52个在GenBank中发现相似性较高、功能已知的EST序列,按其功能分为以下8类:基础能量代谢、跨膜运输蛋白、抗逆或抗病相关蛋白、蛋白质代谢、染色体组成蛋白及DNA复制和转录中的蛋白、信号传导、生长发育调控因子和转录因子,而其中以参与基础能量代谢的基因和抗逆或抗病相关基因所占比例较大。功能已知的52个差异表达片段在玉米1～9号染色体上均有分布,且在非亲和互作前期(6h)主要是一些信号相关基因的表达,12h表达的基因多属于抗病反应初期阶段的相关基因,与防卫有关的基因主要在48～72h表达,生长发育类基因在所检测的非亲和互作的不同阶段均表现作用,在非亲和互作后期主要是蛋白质代谢基因的表达。     

小麦cDNA-AFLP技术体系建立的研究

本研究以小麦栽培品种为材料,对cDNA-AFLP技术的关键技巧作了研究和详细叙述,并建立起该技术体系,为小麦分子育种研究提供借鉴。采用Trizol法提取小麦叶片RNA,按照通常cDNA-AFLP技术方法进行,经过优化试验,使用Trizol法提取RNA,用PCR仪酶切连接,稀释20倍的预扩产物进行选扩后用AFLP银染技术可以得到理想的cDNA-AFLP结果。     

大白菜cDNA-AFLP分析体系的优化

本研究以高感、高抗大白菜小黑点病的大白菜叶柄为试材,对影响cDNA-AFLP分析体系的几个关键因素进行分析,建立了适宜大白菜的cDNA-AFLP分析体系,并得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP图谱。结果表明:试剂盒法提取的NA较完整,纯度较高;400ng的cDNA利用FastDigest EcoRⅠ和Fast-Digest MseⅠ进行快速双酶切50min,酶切充分;在20μL的体系中,连接产物取原液作为预扩增反应的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果最佳;MBI2×PC Master Mixture反应体系满足扩增反应的需要,不需要另外摸索反应条件,节省了试验成本;选用64对AFLP引物进行扩增,筛选出具有多态性条带丰富的AFLP引物45对。本研究为利用cDNA-AFLP分析大白菜小黑点病的的发病机理奠定了基础。