白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

应用AllGlo探针检测对虾白斑综合征病毒研究

用AllGlo探针检测对虾白斑综合征病毒,阳性反应呈典型的S曲线,说明本检测探针和引物设计合理。经灵敏度测定,当样品DNA浓度低至100拷贝/μL时,仍可以有效扩增,但在103/μL之上时结果最佳。同时,经过与传统探针检测对比试验得出:用Taqman标记的探针检测相同量的样品时,AllGlo MAR标记的探针(FAM通道)CT值与FAM标记的探针的CT值没有明显区别,但是MAR标记的探针的荧光信号强度要比FAM标记的探针约高40%,更适合于对虾白斑综合征病毒的检测。     

对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白激酶wsv083的初步研究

为探讨VP19和VP28是否由蛋白激酶wsv083催化发生磷酸化,将wsv083、VP19和VP28分别进行原核表达。将wsv083蛋白、wsv083表达菌株的裂解液上清以及去磷酸化的wsv083蛋白分别和2种膜蛋白相互作用,以及将wsv083、VP19和VP28的表达质粒共转化至同一菌株中进行表达。结果均未能发现VP19和VP28被磷酸化,但发现wsv083蛋白自身具有苏氨酸和酪氨酸磷酸化的现象。改变wsv083表达质粒,wsv083蛋白同样出现了磷酸化现象。而在将wsv083的序列改变使其失去激酶活性后,表达出的wsv083蛋白不再具有磷酸化的现象。因此认为VP19和VP28的磷酸化不是由wsv083催化产生,wsv083能够自我磷酸化。     

对虾白斑综合症病毒PCR检测体系的优化研究

通过改进WSSVPCR模板制备方法、引物的筛选、PCR反应的优化,建立稳定的WSSVPCR检测体系。结果表明,该体系具有稳定、快速、灵敏等特点,可用于生产中对WSSV的检测。     

白斑综合征病毒在养殖克氏原螯虾中感染流行研究

2007年,在从南京采集的患病养殖克氏原螯虾样品超薄切片中发现大量类似对虾白斑综合征病毒(WSSV)颗粒,结合初步的流行病学调查、人工回感实验及PCR检测结果确定导致此次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原为WSSV。利用建立的特异性引物PCR方法,在江苏省内扬州邵伯湖、淮安白马湖、盱眙、南京禄口等多处养殖克氏原螯虾体内均检测到该病毒,且在鳃、心肌、神经、肝脏、肠道、肌肉等多处组织中被检出;未检测到另外两种常见对虾病毒:桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)。     

病原感染条件下中国对虾二倍体和三倍体血液学变化

以热休克诱导获得中国对虾三倍体，通过口服或注射的方式对二倍体和三倍体中国对虾进行了白斑综合征病毒(WSSV)和鳗弧菌感染实验，研究了病原感染前后二倍体和三倍体中国对虾血液学的变化并首次报道了三倍体中国对虾血细胞的组成。实验结果表明：三倍体和二倍体中国对虾均对WSSV敏感，三倍体未显示出明显的抗性。WSSV感染4d后，对虾外周循环系统的血细胞数量明显减少，三倍体和二倍体对虾血细胞数量均降为对照组的10％左右。对虾血细胞组成发生变化，大颗粒细胞明显减少，小颗粒细胞相应增加，而透明细胞所占比例基本不变；大颗粒细胞和小颗粒细胞内颗粒物质均有所减少，出现空泡或细胞外突起等异常结构。注射鳗弧菌感染后两种对虾的血细胞数量均有所减少，血细胞数量的减少与弧菌的注射量呈正相关关系：三倍体中国对虾血细胞组成与二倍体相似，但其密度仅为二倍体的40％左右：本研究结果为三倍体对虾抗逆特性的研究提供了一定依据和参考。     

用DNA斑点杂交法检测对虾及其饵料和环境生物携带白斑综合症病毒状况的调查

于1996-1998年采用DNA斑点杂交法,完成了共计836份养殖对虾,213份对虾饵料和环境生物样品的检测。结果显示,对虾在每年的4-10月都可检测出白斑综合症病毒（WSSV）,6月出现最高峰,阳性检出率达到42.6%;其次,为7月和5月,分别达31.6%和24.5%。在对虾不同生长阶段（包括亲虾、各期幼体、仔虾、幼虾及成虾）均可检出WSSV,其中以仔虾的带毒率最高,达36.4%,其次为糠虾幼体,达34.6%。体长范围1.1-2.0cm的仔虾阳性率最高,其次体长为5.1-6.0cm的幼虾样品。检测的中国对虾样品（625份）带毒率为16.8%,日本对虾样品（211份）带毒率为45.0%。对虾主要饵料及环境生物类群包括鱼类、虾类、蟹类、桡足类、端足类、沙蚕、卤虫均可检出WSSV,其中小型虾类、端足类、桡足类、蟹类样品的WSSV检出率均高于20%。     

家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响

为研究饲料中添加家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响,在基础饲料中分别添加家蝇抗菌肽提取物0、1、2、3、4、5 g/kg,配制6种试验饲料.选取960尾健康、初始体均重为0.86(±0.01)g的凡纳滨对虾,分为6组,饲养8周后进行攻毒试验.结果显示,当抗菌肽提取物添加量为3 g/kg时,72 h内的累计死亡率与对照组相比显著降低.血细胞数量和吞噬率均以3 g/kg组最高,显著高于对照组、1、5g/kg组.当抗菌肽提取物添加量为2～3 g/kg时,对虾血清过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)活性和总抗氧化能力(T-AOC)均维持在一个较高的水平,且显著高于对照组;4 g/kg组超氧化物歧化酶(SOD)活性与对照组相比显著升高,肝胰腺AKP活性、T-AOC水平均以4 g/kg组最高,显著高于对照组;3g/kg组LZM活性显著高于对照组、1、4、5 g/kg组.结果表明,饲料中添加适量的家蝇抗菌肽可以提高凡纳滨对虾的免疫力和抗白斑综合征病毒的能力.     

对虾白斑综合症病毒综述

对虾白斑综合症病毒（W SSV）是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。W SSV是一种无包涵体的杆状病毒,PCR诊断技术具有简便快速、灵敏度高等优点,适合于大规模检测。对W SSV的分子生物学进行深入研究,优化现有的检测技术,积极探索新的检测方法,有效防止W SSV感染产生的危害,以促进对虾养殖业的发展。     

斑节对虾relish基因的克隆及免疫刺激对其mRNA表达水平的影响

relish是Rel/NF-κB家族的重要成员之一。本研究在构建的斑节对虾(Penaeus monodon)肝胰腺转录组文库中克隆得到PmRelish基因,其全长5 112 bp,包括3 561 bp的ORF,推测编码1个含1 186个氨基酸的蛋白。PmRelish的蛋白具有Rel/NF-κB蛋白家族的典型结构特征,包括N端的RHD结构域,核定位信号,C端的6个锚蛋白重复序列以及死亡结构域,表明该蛋白是NF-κB1亚型。该基因在所检测组织中呈组成型表达,并在血细胞表达量最高。使用定量PCR检测PmRelish基因在不同免疫刺激条件下在肝胰腺中的mRNA表达情况,结果显示,肝胰腺PmRelish基因是诱导型表达,并被创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和白斑综合征病毒(WSSV)调控表达,其中被创伤弧菌上调表达最显著。进一步证明了病毒核酸类似物Poly(I:C)、R484可激活PmRelish的表达。上述研究结果说明Relish是斑节对虾的重要免疫因子,可能通过直接或间接作用参与对细菌和病毒的免疫反应。