暗纹东方鲀SRAP-PCR体系的建立与优化

以暗纹东方鲀基因组DNA为材料,利用正交设计L16(45)对影响暗纹东方纯SRAP-PCR反应的5个因素(Mg2、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物)在4个水平上进行正交组合,确立了暗纹东方鲀SRAP反应最佳体系为:20 μL的PCR体系中含有Mg2+ 1.5 mmol·L-1、Taq酶0.5U、模板DNA 75 ng、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物0.2 μmol·L-1.利用30个暗纹东方纯样本对该体系进行验证,结果表明该体系稳定可靠.     

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。     

冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的条件优化

为探索无需卵子失活仅用冷休克方法诱导雄核发育单倍体,以红鳍东方鲀Takifugu rubripes为研究对象,试验选用L_9(3~4)设计,进行3因素3水平的正交试验,处理温度设为0、2、4℃,处理持续时间设为30、45、60 min,处理起始时间设为2、5、8 min,共9个试验组,并对其后代采用单个胚胎染色体计数法进行染色体数目统计及微卫星分析。结果表明:冷休克诱导得到的单倍体率最高为第7试验组和第9试验组,分别为受精后8 min在4℃下处理30 min和受精后5 min在4℃下处理60 min,单倍体率分别为86.7%和80.0%;根据正交试验直观分析结果,得出冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的3因素最优组合为处理温度4℃、处理持续时间60 min、处理起始时间8 min;影响冷休克诱导单倍体的3因素主次顺序为处理温度处理起始时间处理持续时间;微卫星分析结果表明,单倍体携带的遗传基因全部为父本的遗传基因。研究表明,仅用冷休克方法可以成功诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体,雄核发育单倍体率高达86.7%,为进一步研究诱导红鳍东方鲀雄核发育二倍体奠定了基础。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

延迟排卵对红鳍东方鲀卵子质量的影响

为探究红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)延迟排卵对卵子生理生化变化及卵质的影响,人为对性成熟亲鱼推迟1~2周挤卵,并将未推迟挤卵组记为A组,推迟1周挤卵组记为B组,推迟2周挤卵组记为C组,研究推迟排卵后卵子内磷酸酶、苹果酸脱氢酶、唾液酸、总氨基酸以及脂肪酸含量等生化参数变化规律及延迟排卵与受精率的相关性。结果显示,推迟1周排卵后,B组受精率显著下降(P0.05),受精率由A组的86.66%降至57.14%;推迟2周后,C组受精率降至31.89%;卵内酸性磷酸酶活力随产卵期推迟而显著下降(P0.05),并与受精率存在显著正相关(P0.05,R~2=0.705);A组苹果酸脱氢酶活力显著高于B、C两组(P0.05,R~2=0.630),总氨基酸含量亦存在相似变化趋势,A、B组显著高于C组(P0.05,R~2=0.706);此外十四烷酸(C_(14:0))、十五烷酸(C_(15:0))、棕榈酸(C_(16:0))、棕榈油酸(C_(16:1n-7))、a-亚麻酸(C_(18:3n-3))、二十碳五烯酸(EPA)在总脂中比例均在正常组中最高,并与受精率存在显著正相关(P0.05),二十二碳五烯酸(C_(22:5n-3))、二十二碳六烯酸(DHA):二十碳五烯酸(EPA)均与受精率呈显著负相关(P0.05)。结果表明,卵子中磷酸酶、苹果酸脱氢酶、总氨基酸、脂肪酸含量与卵子活力存在相关性,在红鳍东方鲀人工授精时,在亲鱼卵子成熟后1周内进行人工挤卵最为适宜。     

双斑东方鲀精子冷冻保存方法探究

双斑东方鲀(Takifugu bimaculatus)在福建已形成较大规模的养殖产业,但其精卵成熟同步率低、自然交配受精率低等繁殖特点已成为养殖规模化发展的最大制约因素。而精子超低温冷冻保存技术作为直接保存细胞遗传物质的一种有效方法,为双斑东方鲀规模化人工繁育问题的解决提供了方案。研究以复苏后的精子活力为选择指标,开展双斑东方鲀精子冷冻保存方法的研究,对抗冻剂、基础液、精子稀释浓度和降温程序等几个关键影响因素进行了筛选,获得了双斑东方鲀精子的最适冷冻方法:以含5%二甲亚砜(DMSO)的MPRS溶液与精子按1∶1比例稀释,样品在4℃冰箱中平衡30 min,液氮上方10 cm处熏蒸5 min,再下降到5 cm处熏蒸5 min,之后投入液氮。按此方法保存的双斑东方鲀精子在解冻激活后,其活力可达(83±3)%,与相应卵子受精,可得到平均70%的孵化率,可以满足双斑东方鲀规模化人工繁育的需求。研究结果也可为其他东方鲀鱼类的相关研究提供参考。     

暗纹东方鲀胃蛋白酶的分离纯化及部分性质研究

为了探明 pH 值、温度及矿物质离子对暗纹东方鲀胃蛋白酶活性的影响效果,用暗纹东方鲀的胃为材料,经柠檬酸缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,CM-纤维素离子交换柱、Sephedex G75 层析柱纯化,获得比活为 7.13μmol/(min·mg)的胃蛋白酶.酶经聚丙烯酰胺电泳,表现为单一蛋白带,经 SDS-PAGE 测得酶的亚基相对分子质量为18 600.酶水解酪蛋白的最适温度为50 ℃,在pH2.5, ℃下酶催化酪蛋白水解的Km值为0.715 mmol/L;pH5.0, 3737 ℃下酶催化 N-卞氧羰酰 L-赖氨酸对-硝基酚酯(CBZ-Lys.pNP)的 Km 值为 0.112 mmol/L.几种矿物质离子对酶活力的影响表明,Ca2+,Mn2+,Mg2+对酶有激活作用,Zn2+,Fe2+对酶有抑制作用.     

暗纹东方鲀饲料中豆粕替代鱼粉的营养生理效应及其与大豆抗原蛋白的相关性

选择体质量为(39.84±3.09)g暗纹东方鲀,分为8组,分别饲喂等氮等能的高鱼粉组、低鱼粉组、低鱼粉发酵豆粕组、低鱼粉豆粕组4组实用饲料和添加大豆抗原蛋白的半纯化饲料(大豆抗原蛋白含量分别为0%、5%、8%和12.5%),进行为期两个月的生长实验,探讨大豆抗原蛋白对暗纹东方鲀生长和生理生化的影响。结果显示,用发酵豆粕替代部分鱼粉的低鱼粉发酵豆粕组生长性能显著优于低鱼粉组,用豆粕替代部分鱼粉的低鱼粉豆粕组与低鱼粉组无显著差异。半纯化饲料中随着大豆抗原蛋白含量增加,生长率呈现先增后降趋势;实用饲料和半纯化饲料对肌肉组成有不同程度的影响;在肝脏丙二醛、总抗氧化能力和血清丙二醛指标中,低鱼粉豆粕组显著高于低鱼粉组,低鱼粉发酵豆粕组则与低鱼粉组无显著性差异,半纯化饲料系列在8%组出现峰值,显著高于其他组。低鱼粉豆粕组血清谷草转氨酶活性显著高于低鱼粉组,低鱼粉发酵豆粕组与低鱼粉组相比无显著性差异,半纯化饲料组谷草转氨酶和谷丙转氨酶呈现先增后减趋势。研究表明,与豆粕替代鱼粉相比,用发酵豆粕替代鱼粉更能促进鱼体生长;大豆抗原蛋白是影响豆粕替代鱼粉效果的重要因素,但对生长、抗氧化性能和生理生化指标的影响则因大豆抗原蛋白的含量与单独存在与否而异。     

红鳍东方鲀低温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特征分析

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)为暖温性、广温性鱼类,低温的冬季海水会对其生存造成很大影响,因此,选育具有抗寒性状的品系对其产业发展具有重要意义。本研究在利用QTL (quantitative trait locus)定位分析筛选出6个与红鳍东方鲀耐低温相关的候选基因(tacc2、fsip1、exoc4、arhgap44a、pde10a和unc5b)的基础上,通过Real-time PCR检测这6个基因在低温胁迫下在肝脏、心脏和肾脏中表达量的变化。实验用鱼为课题组建立的同一家系的8月龄鱼,共设置3个温度梯度(8 ℃、13 ℃和18 ℃),8 ℃和13 ℃为低温组,18 ℃为对照组。结果显示,6个基因在不同温度下的3个组织中均有不同程度的表达。其中,pde10a基因在3个组织中的表达均呈先升高后下降的趋势;tacc2和exoc4基因在8 ℃组肝脏、肾脏以及心脏中的表达分别呈先下降再趋于稳定、先升高再趋于稳定和先上升后下降的趋势;unc5b基因在肝脏和心脏中的表达量较低,在低温组实验前期的肾脏中呈现高表达;arhgap44a基因在肝脏中的表达呈上升趋势,在心脏和肾脏中整体表达无明显变化;fsip1基因在肝脏中的表达呈下降趋势,在心脏和肾脏中的表达呈先上升后下降的趋势。这6个基因在红鳍东方鲀组织中均随着时间和温度变化具有差异性表达,在低温胁迫下呈现积极响应,表明这6个QTL候选基因在红鳍东方鲀低温适应中具有潜在的重要作用。本研究可为红鳍东方鲀耐低温相关信号通路研究以及耐低温品种选育提供理论依据。