花生四烯酸对日本沼虾肝胰腺细胞脂质代谢基因表达的影响

本试验旨在评价细胞培养液中花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)浓度对日本沼虾肝胰腺细胞活力及脂质代谢相关基因表达的影响。分离日本沼虾肝胰腺细胞,使用M199完全培养液培养5 d后换成含ARA的培养液,ARA浓度分别为0(ARA1)、50(ARA2)、100(ARA3)、200(ARA4)和1 000μmol/L(ARA5),测定12和24 h时脂质代谢相关基因的表达水平,以及24h时细胞活力。结果表明:原代肝胰腺细胞使用完全培养液时,生长状况良好,能存活15 d左右;ARA5组24 h时细胞活力显著低于ARA1和ARA2组(P0.05);高浓度的ARA降低了12和24 h时Δ4脱饱和酶(Δ4 FAD)、Δ6脱饱和酶(Δ6 FAD)、碳链延长酶6(Elovl6)、B类Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ)、脂肪酸结合蛋白10(FABP10)、乙酰辅酶A结合蛋白(ACBP)基因表达水平;ARA作用12 h时,ARA2组SR-BⅠ基因表达水平显著高于其余各组(P0.05),ARA2和ARA3组FABP10基因表达水平显著高于ARA1和ARA5组(P0.05),ARA3组ACBP基因表达水平显著高于其余各组(P0.05);ARA作用24 h时,ARA2组SR-BⅠ、FABP10和ACBP基因表达水平显著高于其余各组(P0.05)。由此可见,细胞培养液中ARA浓度会影响日本沼虾肝胰腺细胞活力及脂质代谢相关基因的表达,过高的ARA浓度(1 000μmol/L)会降低细胞的活力,适宜的ARA浓度(50~100μmol/L)可促进脂肪酸脱饱和酶、碳链延长酶及脂肪酸转运相关基因的表达。     

苜蓿皂苷对大鼠肝脏及肝脏细胞低密度脂蛋白受体、三磷酸腺苷结合盒转运体mRNA表达的影响

本试验旨在研究苜蓿皂苷对大鼠肝脏及大鼠肝脏细胞(BRL细胞)胆固醇清除和转运途径中关键基因低密度脂蛋白受体(LDLR)、三磷酸腺苷结合盒转运体G5(ABCG5)、三磷酸腺苷结合盒转运体G8(ABCG8)mRNA表达量的影响,从个体和细胞水平初步探讨苜蓿皂苷调控胆固醇清除和转运的分子机制。采用高脂饲粮建立大鼠高脂模型,测定苜蓿皂苷对正常、高脂大鼠血清指标[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量]和肝脏LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表达量的影响;采用高糖DMEM培养液建立BRL细胞脂变模型,测定苜蓿皂苷浓度对BRL细胞活性的影响,测定苜蓿皂苷对正常、脂变细胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表达量的影响。结果表明:1)苜蓿皂苷显著降低高脂大鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量(P0.05);2)苜蓿皂苷显著上调正常大鼠肝脏LDLR、ABCG5、ABCG8及高脂大鼠ABCG5、ABCG8 mRNA表达量(P0.05);3)添加200、250μg/m L苜蓿皂苷显著提高了BRL细胞的活性(P0.05);4)苜蓿皂苷显著上调正常BRL细胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表达量(P0.05),而对脂变BRL细胞各基因mRNA表达量无显著影响(P0.05)。结果提示,苜蓿皂苷可通过调控LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA的表达来增加肝细胞内胆固醇的清除和转运,从而降低机体胆固醇的含量。     

伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的原核表达与鉴定

为获得伽氏疏螺旋体尚志株（B. garinii SZ）的P66蛋白,本研究从培养的螺旋体菌液中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,利用PCR扩增P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a（+）,并转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3）,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达和纯化,然后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,获得约70 ku的表达产物;Western blotting分析表明,表达产物与抗His标签的小鼠单克隆抗体、螺旋体鼠源阳性血清、兔抗P66多克隆抗体均能发生反应,获得的多克隆抗体也可识别天然蛋白。本试验成功表达了B. garinii SZ株P66蛋白,并制备了多克隆抗体,为后续B. garinii SZ株P66蛋白的功能研究奠定了基础。     

重组鸡Cathelicidins类抗菌肽的融合表达及其对金黄色葡萄球菌抗菌活性的研究

Cathelicidins抗菌肽在家禽天然免疫系统中发挥重要作用,本研究将已构建的含Cathelicidins抗菌肽成熟肽的阳性克隆菌株Rosetta(DE3)/pET30-CathL1S、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S分别在37℃、1.0 mmol/L IPTG的条件下进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,Cathelicidins成熟肽片段均在大肠杆菌中以融合形式成功表达,表达产物的表观分子质量分别为7、8、7.5 ku。琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,表达产物对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡白痢沙门氏菌C79-13 (Salmonella pullorum)、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌及绿脓杆菌等供试菌株均有较强的抑制作用,尤其对抗生素耐药菌株有明显的抑制作用。以雏鸡为实验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性,结果表明,注射中、高剂量CathL-1抗菌肽试验组(5、10 mg/kg),在试验结束后取肝脏组织匀浆液涂布于TMP平板,未分离到葡萄球菌。各抗菌肽试验组平均增重均高于感染对照组,其中低剂量抗菌肽试验组(2.5 mg/kg)体内抑菌效果虽与普通抗生素相当,但其增重效果尤为明显。     

动物干扰素原核表达及其产物制备方法研究进展

文章对重组动物干扰素基因序列的改造、原核表达条件的筛选、原核表达产物制备方法的研究及大规模生产工艺的研发等方面的发展状况进行了概述,旨在为其大规模生产提供一定的理论依据。     

乙脑病毒PrME基因在杆状病毒表达系统中的表达

本试验将乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）的ＰｒＭ／Ｅ基因的ＨｉｎｄⅢ－ＢｇｌⅡ片段（２．１ｋｂ）插入到杆状病毒载体ｐＡｃＵＷ３１的ＢａｍＨＩ位点,使外源基因置于多角体蛋白启动予下游,构建成转移载体ｐＡｃＵＷ３１ＪＥ,以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ作为共转染试剂,将纯化的ｐＡｃＵＷ３１ＪＥ与Ｂｓｕ３６Ｉ线性化的杆状病毒ＡｃＭＮＰＶ．ＬａｃＺＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９经病毒蚀斑纯化技术和Ｘ－ｇａｌ与中性红双重染色技术,随机     

鸡白细胞介素2原核表达载体的构建及表达产物的鉴定

将鸡白细胞介素2(IL-2)的cDNA克隆到原核表达载体pET-30a( )上，构建原核重组表达质粒pET-IL-2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，37℃用IPTG诱导3.5h后，SDS-PAGE检测表明，表达蛋白以包涵体的形式存在。将诱导后的工程菌超声波裂解，离心后的沉淀用PBS洗涤5～6次，得到高纯度的目的蛋白。     

镉对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响研究

为探讨镉对雌性生殖机能的影响,幼鼠皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后腹腔注射不同剂量的氯化镉,用琼脂糖凝胶电泳及TUNEL法对卵巢颗粒细胞进行凋亡检测;免疫组织化学法检测颗粒细胞的bax表达。结果显示注射氯化镉后48 h的高、中、低剂量组卵巢颗粒细胞(GC)凋亡率分别为(13.887 1±1.329 9)%、(10.757 3±1.229 3)%(、10.020 8±0.983 7)%,均显著高于对照组(0.637 8±0.387 2)%(P<0.01);96 h对照组GC凋亡率显著升高,高剂量组与其它组间差异明显,中、低剂量组与对照组差异不明显。凝胶电泳仅96 h高剂量组呈现梯状带。48 h、96 h各剂量组bax表达明显高于对照组(P<0.01)。可见镉对卵巢颗粒细胞的凋亡有促进作用,并有一定的剂量相关性;TUNEL法检测细胞凋亡优于电泳法,当细胞凋亡率较低时(<20%),电泳检测不到DNA梯状带;卵巢颗粒细胞凋亡和bax的表达有一定的相关性,随凋亡率的升高bax表达呈上升趋势。     

抗盐酸克伦特罗单链抗体基因的克隆、序列分析及表达

提取分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,用一段柔性肽链-(G4S)3将VH和VL连接成ScFv。测序后经NCBI Blast分析,所得ScFv具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征。将所得目的基因与pET-22b( )连接,转化E.coli BL21,用IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析,37℃培养5 h表达量较大,25℃诱导表达以可溶性为主。     

半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)基因在大鼠睾丸组织中的表达及其序列分析

试验根据大鼠肝脏牛磺酸生物合成关键酶——半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)基因已知核苷酸序列,设计了1对特异的寡核苷酸引物,对提取的睾丸组织总RNA进行RT-PCR扩增,扩增出468 bp的DNA片段,在国际上首次证明CSD基因在大鼠睾丸组织中存在表达,即牛磺酸可在大鼠睾丸组织中生物合成。测定了扩增的睾丸组织CSD基因核苷酸序列,并与已知肝脏CSD基因核苷酸序列及其对应的氨基酸序列作了同源性分析。结果表明:睾丸组织CSD基因核苷酸序列同已知肝脏CSD基因核苷酸序列的同源性为99.8%,其对应氨基酸序列的同源性为100%。