低盐压力下缢蛏血淋巴蛋白的比较蛋白质组学研究

应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及图像分析技术寻找缢蛏在低盐环境压力下血淋巴内40kD以下小分子蛋白质组差异,制成肽质指纹图谱,MALDI—TOF—MS测序,通过数据库检索快速鉴定蛋白质或多肽。研究结果表明：低盐压力下,缢蛏血淋巴内有多种蛋白质发生变化,共鉴定出包括磷脂酶A2(Phospho—lipase A2)、锌指蛋白(Zinc Finger Protein)等6种蛋白或多肽,其功能涉及营养、基因表达及蛋白合成调控等方面,说明其血淋巴在缢蛏的防御体系中具有关键性作用。     

福建缢蛏野生群体与养殖群体的ITS-1和ITS-2分析

采用PCR技术对福建缢蛏的霞浦野生群体(WP)和漳湾养殖群体(CZ)进行了ITS-1和ITS-2的多态性分析。利用贝类通用引物扩增了ITS-1和ITS-2序列,PCR产物经纯化、测序、同源序列比对,获得长度分别为495 bp的ITS-1和485 bp的ITS-2核苷酸序列,其中分别包括25 bp和22 bp的插入缺失。ITS-1和ITS-2片段的T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为13.6%、30.2%、28.3%、29.7%(ITS-1),16.2%、33.7%、19.5%、30.6%(ITS-2),A+T含量显著低于G+C含量。序列分析显示,野生群体和养殖群体的单倍型多样性指数、多态位点数、平均核苷酸差异数分别为1.0、40、10.54(ITS-1),0.96、27、11.91(ITS-2)和1.0、28、8.23(ITS-1),0.96、28、10.16(ITS-2),揭示出福建两个缢蛏群体的遗传多样性均较为丰富,其变异主要源于碱基的插入和缺失,野生群体的多样性较高于养殖群体,但是遗传组成存在着较高的一致性,群体间没有遗传分化。     

饥饿再投喂对缢蛏消化酶活力和抗氧化能力的影响

在海水温度8～11℃,盐度20～22,pH7.4～7.9的条件下,将采自福建宁德的5种规格缢蛏(平均壳长0.7cm、1.4cm、2.0cm、4.0cm、6.0cm分别记为N1、N2、N3、N4、N5,其中N1、N2、N3为稚贝)饥饿6d后投喂单胞藻5d,以淀粉酶活力、纤维素酶活力、丙二醛含量和总抗氧化能力为指标,研究了饥饿再投喂期间不同规格缢蛏消化能力和抗氧化能力的变化过程,对缢蛏的补偿生长进行了初步探索。结果显示,缢蛏淀粉酶和纤维素酶活力有随个体增大而下降的趋势,总抗氧化能力随个体增大而升高。饥饿阶段:N1组消化酶活力迅速大幅下降,N2、N3、N4组不同程度升高后下降,N5组在饥饿期间无明显变化;丙二醛含量显著(除N3)降低(P<0.05),2～3d时降至最低,此后开始上升。恢复投喂后各组消化酶活力分别在1～4d升至显著高于饥饿前水平(P<0.05)。恢复投喂3d后N1、N4、N5组丙二醛含量降至显著小于饥饿前水平(P<0.05)。试验期间各规格缢蛏总抗氧化能力无显著变化(P>0.05)。试验结果表明饥饿再投喂对缢蛏抗氧化能力无显著影响但可提高其消化能力,说明可设置合理的饥饿再投喂模式使缢蛏发生补偿生长。     

盐度胁迫对缢蛏渗透压、游离氨基酸及肌肽合成酶基因的影响

缢蛏(Sinonovacula constricta)为广盐性贝类,自身存在抵抗外界盐度胁迫的渗透调节机制。为探究缢蛏在适应盐度胁迫过程中发挥渗透调节作用的主要游离氨基酸(free amino acids, FAA)及其降解途径,本研究测定了不同盐度(5、20和35)胁迫下缢蛏组织的渗透压、FAA含量,并结合其肌肽合成酶基因(carnosine synthase, Sc-CARNS)的表达及相关生理指标的变化研究了Sc-CARNS基因的功能。结果显示,缢蛏鳃、足和血淋巴中渗透压和总游离氨基酸含量随着盐度的升高而升高,且各组织渗透压都在盐度胁迫24 h后达到稳态。此时,缢蛏鳃、足和血淋巴中随盐度变化含量变化最明显的FAA分别为Ala、Gly、Glu、Pro,Ala、Gly、Arg、Tua和Ala、Ser、Thr、Gly。前期研究结果显示,在缢蛏盐度胁迫转录组中,Sc-CARNS表达上调,与盐度调节相关。Sc-CARNS在缢蛏肌肉型组织中表达量最高。低盐胁迫下,Sc-CARNS mRNA表达量和肌肽含量显著升高(P<0.05),丙氨酸(Ala)含量变化趋势与肌肽相反。受RNA干扰后,正常盐度和低盐胁迫下,Sc-CARNS基因在足中mRNA表达量和肌肽含量先下降后升高,丙氨酸含量变化则相反,48 h干扰效率和含量变化最高,且肌肽与丙氨酸是1∶1的转化。结果表明,缢蛏属于渗透压随变者,体内FAA中的丙氨酸在渗透调节方面的贡献率最大,肌肽合成酶(CARNS)是丙氨酸代谢为肌肽的关键酶,参与渗透压调节过程。本研究揭示了低盐胁迫下缢蛏渗透压调节的关键机理,为揭示竹蛏科(Solenida)贝类独特的盐度耐受性机制提供了依据。     

乳山湾缢蛏养殖老化滩涂的修复研究

采用翻耕和翻耕并筑池的物理修复方式对乳山湾西流区面积约为8．67hm^2的老化滩涂进行了修复和缢蛏养殖实验。实验从2003年3月投播蛏苗到2004年7月成蛏收获，共进行了16个月。结果表明，（1）翻耕30、45cm和翻耕筑池3种修复方式均显示出一定的效果，修复区缢蛏生物量分别比对照区高0．33、0．26和0．59kg／m^2，平均壳长分别高1．9、1．4和6．1mm。3种修复方式中，以翻耕筑池的效果最佳。（2）修复区和对照区缢蛏产量与底质中硫化物和有机碳的平均含量大致呈线性负相关关系，与平均泥温的关系不明显。     

盐度和pH对缢蛏耗氧率及排氨率的影响

缢蛏(Sinonovaculaconstricta)分为壳长约4 0、5 0、6 0cm3组。通过实验生态学方法研究缢蛏在不同盐度和pH下的耗氧率和排氨率变化规律。结果表明,盐度对缢蛏的耗氧率和排氨率有极显著影响(F>F0.01),且缢蛏单位体重耗氧率、排氨率随其个体的增大而变小;当盐度为6～30时,缢蛏的耗氧率和排氨率呈1个峰值变化,在盐度22时均达到最大值。pH对缢蛏的耗氧率无显著影响(FF0.01),此时,缢蛏的排氨率出现1个峰值变化,当pH为8时达到最大值。     

象山缢蛏养殖群体和野生群体遗传多样性的比较

于2001年4月，在浙江象山港虾塘和象山外海滩涂分别采集100个缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)样品，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析了2个群体各38个样本的EST、ADH、MDH、IDH、ME、LDH、GDH、SOD、SDH、ATP等10种同工酶，分别记录了30、29个基因位点。其中s-MDH-1、SDH、s—ME、ATP-1、ATP-2等5个位点为多态位点。象山野生缢蛏群体的多态位点比例(17．24％)和群体平均杂合度观察值(0．0377)都明显高于养殖群体(16．67％，0．0314)。结果表明，与其他贝类比较缢蛏象山养殖和象山野生群体拥有较低的遗传变异水平，其中象山野生群体比养殖群体遗传变异水平高。     

不同月龄缢蛏新品种数量性状的相关与通径分析

为了检测缢蛏新品种"申浙1号"不同月龄数量性状间的相关性。随机选取4、9、11月龄缢蛏个体60个以上,测量其壳长(SL)、壳高(SH)、壳宽(SW)、活体质量(W),采用相关与通径分析方法分析壳形态性状对活体质量的作用效果。结果显示,各数量性状之间的相关关系均达到极显著水平,其中与4、11月龄质量相关系数最大的是壳长,分别为0.911、0.631,与9月龄活体质量相关系数最大的是壳高,为0.653。通径分析结果显示,对4、9、11月龄活体质量的直接影响最大的分别是壳长(0.562)、壳宽(0.433)、壳高(0.394),决定系数与以上通径分析结果的变化趋势一致。利用逐步回归的方法分别建立4、9、11月龄缢蛏活体质量(W)的最优回归方程:W4=–0.756+0.039SL+0.112SW,R2=0.849;W9=–10.622+0.095SL+0.404SH+0.644SW,R2=0.631;W11=–23.772+0.207SL+0.805SH+0.587SW,R2=0.909。研究结果为缢蛏人工选育过程中的亲贝选择和产量预测等提供了基础数据。     

温度应激下缢蛏血淋巴蛋白质组的比较研究

缢蛏(Sinonovaculaconstricta,Lamarck)历来是我国沿海重要的经济养殖贝类。本文应用蛋白质组学方法探求其在高温环境应激下血淋巴内40000U以下小分子蛋白质组的变化,寻找缢蛏血淋巴的抗性机制。在高温应激下,缢蛏血淋巴内有多种蛋白发生变化,最终鉴定出2种蛋白质:锌指蛋白及IBP-CARCRchelonianin。本研究也初步证明了蛋白质组理论及技术在分析生态学问题时的适用性及灵活性。     

缢蛏Toll样受体家族基因全基因组水平鉴定及其在弧菌刺激下的表达分析

缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国传统的四大海水养殖贝类之一,养殖过程中易受病原菌感染而造成大量死亡和经济损失。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是目前研究最多的模式识别受体,在无脊椎动物的先天性免疫中发挥着重要作用。研究缢蛏TLR分子特征及其免疫功能对预防和控制病原菌感染至关重要。本研究从缢蛏基因组序列中鉴定出42个TLR基因(ScTLR),其中,33个编码典型的TLR蛋白,其他9个为TLR样蛋白。根据蛋白结构域特点,将典型的TLR蛋白分为2大类4个亚类,一类为多半胱氨酸簇TLR (mccTLR),包括1个P型TLR和7个sPP型TLR;另一类为单半胱氨酸簇TLR (sccTLR),包括16个sP型TLR和9个Ls型TLR。与其他9种软体动物TLR基因的类型和数目比较结果显示,缢蛏基因组中未发现其他软体动物中存在的V型和Twin-TIR型TLR,起源古老的mccTLR类群在软体动物中没有大规模的扩张,而起源较晚的sccTLR类群却发生了大规模的扩张。荧光定量PCR分析显示,6种ScTLR在检测的7种组织中普遍表达,且在血细胞、鳃和肝胰腺组织中高表达。最后,副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)胁迫12 h和48 h的缢蛏鳃和肝胰腺转录组数据分析显示,副溶血弧菌感染前后9个TLR基因在鳃或肝胰腺中的表达量发生显著变化,6个基因(ctg118.25、ctg118.26、ctg356.25、ctg774.6、ctg681.6和ctg1513.5)在感染12 h或48 h后的鳃组织中表达差异显著,前5个基因表达量上调,仅ctg1513.5表达量下调;3个基因(ctg467.9、ctg2496.3和ctg903.17)在感染12 h或48 h后的肝胰腺中表达差异显著,其中,ctg467.9和ctg2496.3表达量下调,ctg903.17表达量上调。综上所述,本研究结果将为深入探讨不同TLR基因在缢蛏天然免疫中发挥的作用提供研究基础。