魁蚶过氧化氢酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(Sb CAT)基因c DNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。Sb CAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,Sb CAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,Sb CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测了Sb CAT的组织表达特征。结果显示,Sb CAT m RNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,Sb CAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。     

温度对魁蚶能量代谢及抗氧化酶活性的影响

采用实验生态学方法,研究了魁蚶能量代谢及抗氧化酶活性对不同温度水平(20、23、26和29°C)的响应。结果显示,魁蚶的摄食率和排粪率都随着温度的升高而降低,单因素方差分析表明,温度显著影响魁蚶摄食率,而对排粪率的影响不显著。魁蚶耗氧率和排氨率随温度的升高呈先增高后降低的趋势,均显著受温度影响。通过建立能量收支方程,发现温度影响魁蚶的能量分配,20°C魁蚶呼吸能占13.71%、排泄能占1.89%、排粪能占22.94%、生长能占61.47%,但是超过20°C,摄食能显著减少,生长余力甚至出现负值。方差分析表明,温度对魁蚶的摄食能和生长余力均具有显著影响。魁蚶外套膜、鳃和肝胰腺的抗氧化酶活性分别在实验开始后的0、4、8、12、24、48和72 h取样检测,在20～29°C,魁蚶体内的T-AOC呈先升高后降低的趋势,且29°C温度下的T-AOC均低于其他温度组。短期内的高温刺激能够促使SOD和CAT活性升高,但超过24 h其组织中的SOD和CAT活性降低,其中鳃和肝胰腺的SOD和CAT活性受温度影响显著,而外套膜受温度影响不显著。GST活性在4～12 h内随着温度升高而显著升高,而在24 h后,尤其当温度升至29°C时,GST活性显著下降。本研究推测,高温对魁蚶的能量代谢及免疫能力造成严重的影响,导致机体抗氧化能力下降,这可能是夏季魁蚶死亡率较高的一个重要原因。研究表明,魁蚶的适宜温度狭窄,建议在魁蚶养殖生产中,水温应低于23°C,超过26°C会导致机体大量的能量消耗。     

底质粒径和水温对不同规格毛蚶苗潜沙能力的影响

为探究底质粒径和水温对毛蚶Scapharca subcrenata苗潜沙能力的影响,以小、中、大3种规格的毛蚶(壳长分别为5~8、9~12、13~15 mm)为试验对象,并以细、中、粗3种沙(粒径分别为125~250、251~500、501~1000μm)为底质,进行了不同底质粒径对不同规格毛蚶苗潜沙率影响的研究,同时进行了水温(5、9、13、17、21、25℃)对不同规格毛蚶潜沙率影响的研究。结果表明:试验初期(10min),小、中、大3种规格的毛蚶在粗粒径底质中的潜沙率总体低于细、中粒径底质条件下的潜沙率,并分别在300、60、120 min时达到细粒径底质条件下的潜沙率;480 min前,小规格组毛蚶的潜沙率总体高于同期中、大规格组,480 min后,大规格组毛蚶的潜沙率总体高于同期中、小规格组;试验结束(1440min)时,底质粒径对毛蚶潜沙率的影响均不显著(P0.05),相对小规格个体,大规格毛蚶潜沙率更高;当水温为21℃及以下时,毛蚶潜沙率随着温度的升高而升高;水温为25℃时,试验初期(40 min)毛蚶的潜沙率较高,但之后潜沙率上升缓慢且出现个体死亡现象。研究表明:壳长为5~12 mm的毛蚶在粒径为251~500μm的底质条件下潜沙率较高,而壳长为13~15 mm的毛蚶在粒径为125~250μm的底质条件下潜沙率较高;水温21℃时,壳长为9~12 mm的毛蚶潜沙率最高。     

魁蚶4个地理群体遗传结构的RAPD分析

应用RAPD标记技术对魁蚶Scapharca broughtonii1个韩国群体与3个中国群体的遗传多样性进行RAPD分析。对4个群体的133个个体进行扩增,共检测到171个位点。其中,多态性位点为167个,4个群体的多态性位点比例:韩国群体为86.55%、黄岛群体为90.06%、蓬莱群体为85.96%和前三岛群体为89.47%;4个群体的Shannon’s多样性指数为(0.460±0.232)~(0.491±0.214),Nei’s多样性指数为(0.308±0.171)~(0.331±0.199),表明4个群体遗传多态性较高;4个群体遗传分化指数在0.006~0.121之间。其中,韩国与中国的3个群体分化明显,说明韩国与中国3个群体的遗传结构差异较大,黄岛群体与前三岛群体间的遗传分化最小。基于4个群体Nei’s遗传距离的UPGMA方法进行聚类分析显示,黄岛群体与前三岛群体最先聚类,两群体间距离最短,再与蓬莱群体聚类,最后与韩国群体聚类。这些数据可为魁蚶种质资源的合理开发和保护及遗传改良提供科学依据。     

魁蚶精子发生的超微结构

利用透射电镜(TEM)技术观察了魁蚶精子发生过程的超微结构变化。结果表明:魁蚶精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子形成等过程,在精子形成中的主要细胞学事件包括顶体的发育、核形态变化及尾部的形成等。此过程中,前顶体颗粒聚集、融合,形成顶体囊,然后发育为圆锥形顶体;核的形态由圆形或卵圆形变为鼓形,核内染色质由团块状到颗粒状,再到高电子密度均质;线粒体聚集、融合、体积变大,迁移至核的后端,参与精子中段的形成。成熟精子由头部、中段及尾部组成,头部由顶体及核构成,中段由5个线粒体围绕远端中心粒组成,尾部为细长的鞭毛。研究亮点:魁蚶为我国重要的海产经济贝类之一,目前对其精子发生过程的超微结构未见研究报道。利用透射电镜技术观察了魁蚶精子发生过程中精子顶体的形成、核的形态建成等主要细胞学事件,探明了魁蚶精子属原生型,顶体物质的合成始于初级精母细胞时期,细胞核在精子发生过程中形态变化不大等问题,为蚶科精子发生机制的深入研究提供了参考。     

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、dNTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化.结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,dNTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L.该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应.使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测.研究表明,实验所建立的OsHV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强.由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料GeneFinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景.     

软体动物毛蚶RNA干扰技术的应用研究

为了在软体动物中建立RNA干扰技术,以用于毛蚶基因功能研究。通过体外转录技术合成双链RNA,并将其注射毛蚶干扰目标基因的表达。肌肉注射双链RNA 48 h后取样,用RT-PCR技术检测目标基因的表达变化,以确定干扰的有效性。结果显示：各目标基因的表达均能被各自特异的双链RNA有效干扰而降低。在注射双链RNA后不同时间点,即12、48、72、96、120 h,取样检测目标基因的时序表达,以确定目标基因表达被干扰的时间效应。发现目标基因的表达在48 h即能有效降低,而且有效时间能持续至120 h以上。对注射双链RNA的动物个体,于48 h取样检测不同组织的目标基因表达,发现毛蚶的RNA干扰效应能系统性地在不同组织发生,表明干扰效应能在不同组织之间进行传递。因此,本研究报道了一种稳定的毛蚶RNA干扰技术,为在毛蚶中进行基因功能鉴定和抗病毒研究提供了一个有效的分子生物学的方法。     

魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表达分析

通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素(C-type lectin,Sb-Lec1)基因,该基因全长为700 bp,其中,5′-UTR为29 bp,3′-UTR为167 bp,开放阅读框长度为504 bp,编码167个氨基酸,包括长度为23个氨基酸的信号肽序列、129个氨基酸的糖识别结构域(CRD)以及参与二硫键形成的6个半胱氨酸。预测蛋白分子量为19.11 k Da,理论等电点为4.74。多序列比对结果显示,Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与长牡蛎(Crassostrea gigas)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和海湾扇贝(Argopecten irradians)C型凝集素的同源性分别为38%~40%、34%~35%和38%~39%,Sb-Lec1基因编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构,均含有形成二硫键的4个保守半胱氨酸。系统进化分析结果显示,魁蚶先与贝类聚为一支,再与脊椎动物聚在一起,表明魁蚶Sb-Lec1基因在进化树上的位置与其传统分类所处位置一致。采用荧光定量PCR技术,检测了Sb-Lec1基因在组织中的表达情况,发现其在肝胰腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、斧足中均有表达,其中,肝胰腺表达量最高。同时,分析了Sb-Lec1基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的mRNA表达量变化情况。结果显示,与对照组相比,菌刺激组Sb-Lec1基因mRNA在各检测组织中的表达量均显著上调(P0.05),随着刺激时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势。本研究表明,魁蚶Sb-Lec1基因在机体免疫防御方面发挥重要功能。     

毛蚶对单胞藻的滤除率、选择性和消化状况

测定了不同水温下毛蚶对5种单胞藻的滤除率、选择性和表观消化状况,结果表明,在16℃~24℃的水温范围内,毛蚶对海洋小球藻的滤除率逐步升高,24℃时的最大滤除率为1.849 4(mL/ind.min),24℃~26℃时的滤除率逐步下降。22℃为毛蚶对微绿球藻、球等鞭金藻3011和三角褐指藻的最佳滤食温度,最大滤除率分别为1.142 4、3.804 5和4.430 4。水温8℃~24℃之间,毛蚶对巴夫藻的滤除率变化不明显,平均滤除率为2.797 2。毛蚶不仅对不同大小、形状的藻类具有选择性,而且对大小、形状相似的藻类也具有明显的选择性。水温22℃下,毛蚶对5种单胞藻的表观消化状况不同。贝类对其滤除率大、消化状况差的藻类在促进贝类净化进程中有良好的应用参考价值。     

魁蚶耗氧率的初步研究

本文测定报道了不同规格魁蚶在11、14、20、23℃条件下不同活动水平的耗氧率。结果表明,在相同温度条件下,单位体重耗氧率随体重的增加而下降,随活动水平的加强而升高,另外,单位体重耗氧率亦随温度的升高而增加。11～23℃内耗氧率介于0.28～1.05ml O_2/g干肉重/小时,或介于0.038～0.126ml O_2/g活体重/小时之间。统计得出了11～23℃内魁蚶耗氧率与壳长、体重(活体重、总干重、干肉重)的指数回归公式,其中体重回归式中的指数b为0.642。计算了11～23℃的Q_(10)值为1.75。