马立克氏病病毒糖蛋白gC多克隆抗体的制备及反应特异性研究

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)糖蛋白C(glycoprotein C,gC)是参与MDV水平传播的重要毒力因子,但其具体作用机制尚未明确。研究gC蛋白所需的抗体在国内未见报道,为简化抗体制备程序,本研究采用合成抗原肽免疫的策略,通过生物信息学软件分析发现gC蛋白的优势抗原表位主要集中在其69～85氨基酸区段,据此合成肽段N-NSESTNEHTITETTGKN-C作为抗原免疫日本大耳白兔。在有弗氏佐剂条件下,5次免疫后采集抗血清,斑点印迹试验显示制备的抗gC多克隆抗体与合成肽的反应效价为1∶10 000;经亲和层析柱纯化后的gC抗体具有良好的反应特异性,对转染或MDV感染的细胞中运用免疫荧光试验和免疫印迹技术均能检测到特异的阳性信号。与疫苗毒相比,广西野毒分离株gC蛋白的免疫荧光信号更强。本研究获得的MDV的gC多克隆抗体可用于后续对gC蛋白功能的研究。     

牛妊娠相关糖蛋白boPAG2双抗体夹心ELISA体系的建立

【目的】通过双抗体夹心ELISA体系实现对牛妊娠相关糖蛋白boPAG2的免疫学检测,为后续研发牛妊娠检测试剂盒奠定基础。【方法】将自制boPAG2作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,以细胞融合技术对呈阳性的杂交瘤细胞进行筛选。运用ELISA相加性试验筛选最佳配对抗体,初步建立起双抗体夹心酶联免疫吸附试验系统,采集牛场中120头荷斯坦奶牛血清样本进行初筛。【结果】筛选出3株能稳定分泌boPAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2C01,5E02,3B05。纯化出单克隆抗体滴度为(1∶22.48×10⁴)～(1∶11.96×10⁴),免疫球蛋白亚型均为IgG。ELISA相加性试验筛选出2株可识别boPAG2抗原不同表位的最佳配对抗体5E02和3B05。当5E02作为包被抗体,3B05作为检测抗体时,其最佳稀释质量浓度为1.25μg/mL,检测boPAG2的灵敏度可达5μg/mL。【结论】制备和选定了两株最佳配对单克隆抗体5E02和3B05,该对抗体效价高,通过建立双抗体夹心ELISA体系实现对boPAG2的免疫学检测,并对少量血清样品进行了初步...     

3种细胞穿透肽对体外转录mRNA的递送效果

为了开发合适的mRNA递送载体，本试验采用体外转录、加帽、加尾修饰及氯化锂(LiCl)纯化的方法获得具有生物活性的绿色荧光蛋白mRNA(mRNA-EGFP),然后用合成的3种细胞穿透肽(RVG、RVG9dR、RVG11dR)进行递送。先通过凝胶阻滞试验确定mRNA与3种细胞穿透肽的最佳包被质量比例；再在293T细胞水平上测试3种细胞穿透肽的细胞毒性、包被mRNA后对RNase A的耐受性，并通过凝胶阻滞试验和细胞荧光试验来测试3种细胞穿透肽对mRNA的包被和递送效力。细胞毒性试验结果显示，3种细胞穿透肽的半抑制浓度(IC₅₀)分别是95、90μmol/L和81μmol/L;RNase A保护试验结果显示，3种细胞穿透肽均可保护mRNA不被RNase A降解；凝胶阻滞试验和细胞荧光试验结果显示，3种细胞穿透肽均可成功包被mRNA-EGFP,并把mRNA递送到细胞内进行表达，其中RVG11dR对mRNA的递送效果最好。结果表明，在细胞穿透肽RVG的末端添加一定数量的精氨酸可提高其对mRNA的递送效力。     

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gB和gD的研究进展

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）是牛的重要传染病，临床以呼吸道症状为主，伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV），又称牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus 1,BHV-1），共编码30～40种结构蛋白，其中11种为囊膜糖蛋白。糖蛋白在病毒吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。糖蛋白gB对病毒侵入宿主细胞、在细胞间扩散及复制至关重要；糖蛋白gD在病毒复制、传播和感染机制方面作用重大，具有良好的免疫原性，是诱导产生中和抗体的主要糖蛋白。对gB、gD的研究不仅可从蛋白层面解析病毒侵染机制，还能够为牛传染性鼻气管炎的临床诊断和预防提供理论依据。本文针对牛传染性鼻气管炎病毒的主要糖蛋白gB、gD的研究结果进行综述，分析其生物学功能以及在疫苗和诊断方面的应用，以期为牛传染性鼻气管炎侵染机制和防控提供参考。     

马疱疹病毒8型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法，本试验以EHV-8的全基因组序列为模板，针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列，进行对比分析，设计EHV-8的特异性引物和探针，优化反应条件，建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证，使用该方法进行临床样本检测。结果显示，建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×10² copies/μL,敏感性高；EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应，特异性强；批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示，阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见，本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求，且该方法敏感性高、特异性强、重复性好，为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。     

人参皂苷Rh2通过激活Akt和Erk通路促进神经分化

目的研究人参皂苷Rh2的促神经分化作用,初步明确相关分子机制。方法将细胞分为对照组、实验组,使用MTT检测Rh2对细胞毒性的影响,筛选最适药物浓度,用倒置相差显微镜观察拍照,使用Image-J软件对照片进行细胞分化率和神经突起长度统计分析,用Western Blotting检测其促神经分化所激活的信号通路,之后用相关通路抑制剂加以干预,检测神经突起长度、分化率和相关通路的蛋白表达变化。结果人参皂苷Rh2浓度在2~6μM不影响细胞存活,能够促进神经分化,随剂量依赖性增加,其中6μM的效果最显著,其通过激活PI3K/Akt、MEK/Erk发挥作用,其中p-Akt和p-Erk在30 min表达最明显,Rh2可以降低由于PI3K/Akt、MEK/Erk抑制剂所致p-Akt、p-Erk抑制的效果。结论人参皂苷Rh2促进神经突起生长、增加和延长,具有较好促进神经分化的效果,具有开发为治疗神经退行性疾病的潜力。     

家畜早期妊娠诊断的研究进展

本文从原理、方法、诊断时间和准确率等方面对家畜妊娠临床诊断法、实验室诊断法以及胎儿游离DNA检测法进行综述，总结了不同妊娠诊断方法的优缺点、发展趋势以及实际应用效果，为探索不同应用场景下适宜的家畜妊娠诊断方法提供参考。传统的临床诊断法具有快捷经济的优点，但准确率受人为操作影响较大；实验室诊断法提高了准确率，提早了检测时间，但存在成本高和检测标准不统一的局限性；胎儿游离DNA检测法可用于家畜胎儿性别鉴定，而非性别依赖性胎儿DNA特异性标志物仍需进一步探索。