基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的樱桃病毒A(CVA)的检测方法

根据樱桃病毒A(cherry virus A,CVA)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了樱桃中CVA的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法。该方法可在恒温38℃条件下进行,40 min即可完成检测。灵敏度试验表明,采用RPA方法检测CVA的灵敏性是PCR方法的10倍,且与侵染樱桃的另外6种病毒和1种类病毒无交叉反应。此外,具有标记的扩增子可通过侧向流试纸条直接观察结果。采用该方法检测田间样品效果良好。     

西瓜细菌性果斑病菌现场快速双模荧光RPA检测方法的建立

瓜类细菌性果斑病菌(bacrerial fruit of blotch,BFB)是中国检疫性病害,其传播非常迅猛,且目前没有商品化抗病品种。为建立西瓜果斑病菌现场快速荧光重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,针对细菌性果斑病菌特异性序列设计并筛选出了RPA最佳的引物和探针组合,利用两种模式[实时荧光监测RPA(real time RPA,RT-RPA)和终端荧光可视化检测RPA(end point RPA,EP-RPA)]对RPA的结果进行分析,并与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果进行对比。结果显示,建立的细菌性果斑病菌双模荧光RPA检测方法特异性强,且其对病原物的检测灵敏度与qRT-PCR的灵敏度相当。在实际样品检测中,RT-RPA、EP-RPA和RT-PCR的检测结果一致性为100%。在检测时间上,EP-RPA的检测时间为20 min,RT-RPA平均检测时间约为5 min,qRT-PCR的平均检测时间约为44 min;RPA的检测速度最快,而且不依赖大型的仪器,方便快捷,适用于现场检测。该恒温快速检测方法的建立为植物病害的现场检测提供了新的技术支持。     

Development of the Recombinase Polymerase Amplification Assay for Rapid Detection of Porcine Parvovirus

This study was aimed to develop a simple and rapid method for the porcine parvovirus (PPV) with recombinase polymerase amplification (RPA), which could be a novel and reliable tool for the control and detect of PPV. The RPA was developed using specific primers for the conserved region of PPV VP2 gene. The reaction time was optimized,the RPA reaction could amplify the PPV, and was performed successfully at 38℃ for 30 min in a water bath. The results showed that the detection limit of RPA was 102 copies of plasmid DNA, which was the same as the Real-time quantitative PCR applied in this study, and 100 times more sensitive than conventional PCR. For the clinical samples from the suspected PPV-infected pigs, the positive detection ratio was 82.6% for RPA, which was lower than that of Real-time quantitative PCR (86.9%), but was much higher than conventional PCR (66.7%). The PPV RPA assay developed in the study was simple, rapid and reliable, and was suitable for rapid detection of PPV.     

RPA201772防除甘蔗田杂草和安全性试验

通过RPA201772在甘蔗园的田间药效试验，结果表明：在甘蔗定植后芽前每公顷施用RPA201772 84g(有效成份)，对园地禾本科杂草和阔叶杂草有较好的防效，施药后60d，对杂草总株防效达85．7％，鲜重防效达99．5％。甘蔗苗新抽生的叶片对RPA201772会产生轻微的白化反应，但不影响甘蔗的正常生长。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的猪流行性腹泻病毒（PEDV）分子检测方法,本研究基于PEDV病毒M基因保守序列,设计一系列扩增引物及其荧光探针,以包含PEDV病毒M基因片段的pUC57质粒为模板,同时以包含猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及古典猪瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列的质粒作为对照,建立了一种PEDV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法,测定了方法的特异性与敏感性。结果表明,该实时荧光RPA方法可在39℃恒温反应20 min特异性扩增PEDV病毒M基因,与TGEV、PRRSV等对照病毒基因无交叉反应,其检测限为10拷贝/μL。应用该实时荧光RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的实时荧光RPA检测方法简单、快速、灵敏度高,可为PEDV的检测防控提供一种新的、可靠的技术支持。     

多效抗旱驱鼠剂在飞播造林中的应用研究

用多效抗旱驱鼠剂 (RPA)对飞播用油松、侧柏种子进行拌种处理 ,室内外做发芽及生长试验。结果表明 ,室内RPA的 3个浓度处理油松发芽率比对照提高 13.9%　 2 9.8% ,侧柏发芽率提高 2 4 .6 %　 2 7.0 % ;油松高生长比对照提高了 9.0 %　 19.4 % ,侧柏提高了 2 9.4 %　 5 8.8% ,油松成苗率比对照提高 18.5 %　 36 .0 % ,侧柏提高了 2 4 .0 %　 2 7.5 %。在促进成苗率的同时也促进了苗木根系的生长 ,RPA使油松根系生长比对照提高了 34.6 %　 5 0 .0 % ,侧柏根系生长提高了 13.9%　 36 .1%。在飞播上应用 ,RPA处理区有苗样方率远远高于对照区 ,处理区苗木分布比较均匀 ,从保存的株数看 ,对照区仅为 0 .0 7株·m- 2 ,而处理区高达 0 .5　 0 .8株·m- 2 ;对照区苗木平均高 2　 3cm ,处理区为 3　 5cm。充分说明多效抗旱驱鼠剂在苗圃育苗或飞播造林中应用 ,能够提高成苗率 ,促进苗木木质化程度 ,使苗木安全越冬 ,促进苗木根系的生长 ,起到以根提水 ,以水促长的作用     

多效抗旱驱鼠剂室内驱避鸟兽试验研究

通过选食和迫食试验，多效抗旱驱鼠剂室内对大山雀、野灰鸽、小白鼠、小家鼠、鼠兔等有较强的驱避作用。选食试验，用RPA处理的种子保存率达78．3％－100％，迫食试验，达71．9％－89．6％，通过差异显著性检验，各处理间差异显著。     

2种植物抗逆剂对苗木抗旱促长作用研究

纳米型植物抗逆剂（NPA）是西北农林科技大学鼠害治理研究中心研制的无公害多功能植物保健剂,集抗旱、保水、促长和预防鼠（兔）害功能于一体。为了研究NPA对苗木作用的效果,以多效抗旱驱鼠剂（RPA）为参照,采用模拟蘸浆造林方法,比较了2种药剂对油松和侧柏抗旱促长作用差异。结果显示,用150倍NPA和RPA水溶液兑成泥浆对苗木抗旱均有较好的促进作用。NPA对苗木保存率、苗高、地径和根长的促进作用大于RPA,且在低水分组和油松上表现尤为明显。     

多效抗旱驱鼠剂（RPA）飞播油松拌种成效分析

选择陕西汉中市、安康市、商州市和淳化县播区1997年飞播油松为对象,1998年-2003年10月,在各播区的多效抗旱驱鼠剂（RPA）处理区和对照区随机抽取50块1 m×2 m样方调查苗木数量,以有苗样方频度、成苗量和增益指数为指标,采用ANOVA-LSD均值检验法和模型分析法,分析RPA和对照油松有苗样方频度和成苗量差异和动态,评价成苗效果,衡量RPA增益效果。按国标判定,RPA处理区第1年有苗样方频度全优,5年后均不合格;对照区第1年,汉中试验区4优、1良,安康试验区3优、2良,商州试验区1优、4良,淳化试验区1优、2良、2合格,3年后均不合格。飞播后第1年RPA和对照的苗木保存量均评定为优;第5年,RPA为优,而对照区汉中试验区的判定为合格,安康、商州和淳化试验区的为不合格。有苗样方频度和和苗木保存量与飞播年限关系均符合Inverse-模型,且RPA模型值明显大于对照;飞播后第1年至第3年有苗样方频度和和苗木保存量减少量占总减少量的85.0%,不宜进行飞播造林成效评估。RPA对有苗样方增益作用淳化最高,地区整体差异极显著（p=0.005）;而对有效苗增益作用相对稳定,地区差异不显著（p=0.395）。     

液相色谱法测定苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻中的贮存稳定性

建立了苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻样品中残留的高效液相色谱分析方法,并研究了二者在水稻样品中的贮存稳定性。贮存在-18℃和-20℃下水稻样品经提取净化后,采用高效液相色谱仪-紫外检测器,在240nm波长下对试样中的苄嘧磺隆和仲丁灵进行分离和定量分析。结果表明,苄嘧磺隆和仲丁灵的峰响应面积与进样浓度呈现良好的线性关系,其相关系数分别为0.999 7和0.999 9。苄嘧磺隆的相对标准偏差为0.5%~12.0%,回收率为77.2%~104.6%。仲丁灵的相对标准偏差为0.8%~7.6%,回收率为73.0%~106.4%。苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻5种基质中贮存90d后分解率小于5%,符合FAO/WHO联合标准的等同认定要求。苄嘧磺隆和仲丁灵具有良好的稳定性。