脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制

【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞 (spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO（Gene ontology）分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸（retinoic acid,RA）以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸 (piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,qRT-PCR（quantitative real time PCR）检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,与RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现：在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参与视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参与视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化与体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组（BLANK）【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。     

水稻LOC_Os10g05490位点冷胁迫条件下表达分析及CRISPR/Cas9定向编辑

为探明LOC_Os10g05490位点冷胁迫条件下的表达特性和耐冷性功能,以耐冷东乡野生稻和冷敏感水稻93-11为试验材料进行了半定量分析,结果表明,LOC_Os10g05490在冷敏感水稻93-11冷处理前后表达丰度相当,而在耐冷东乡野生稻中冷处理后表达丰度下调,这一结果与前期转录组测序(RNA-seq)结果相符,进一步验证了该位点可能与水稻耐冷相关,随后利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对LOC_Os10g05490编码区于同样具有较强耐冷性的粳稻品种台北309中实施定向基因敲除,并成功获得了26株转基因阳性植株。     

干旱胁迫下野生大豆ABC转运蛋白转录组测序分析

为获取干旱胁迫状态下ABC转运蛋白家族相关基因,以抗旱性强的野生大豆为试验材料,浇灌20%PEG 6000模拟干旱胁迫,分别在干旱处理0、 6、12、24和48 h后取叶片提取RNA进行转录组测序;以GO、KEGG和NR三大数据库注释的结果为基础,再以ABC转运蛋白为关键词进行筛选。结果表明,共获得337条ABC转运蛋白相关序列,包括8大亚家族(ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG和ABCI)。差异表达分析结果表明,共有182条表现差异表达。GO注释到的差异表达基因多数为嘌呤核苷酸分解过程,KEGG注释到的差异表达基因分布在5个亚家族(ABCA、ABCB、ABCC、ABCD和ABCG)。对NR数据库有注释的168条差异表达基因进行进化分析,结果表明ABCE、ABCF、ABCG家族与ABCI11为一类,ABCB、ABCC家族与ABCI10为一类,ABCA、ABCD家族与ABCI19为一类。本研究为进一步研究野生大豆干旱胁迫下ABC转运蛋白抗旱基因提供了一定的理论依据。     

Assignment of unanchored scaffolds in genome of Brassica napus by RNA-seq analysis in a complete set of Brassica rapa-Brassica oleracea monosomic addition lines

The economically valuable oil crop Brassica napus(AACC, 2 n=38), which arose from interspecific hybridization between the diploid ancestors Brassica rapa(AA, 2 n=20) and Brassica oleracea(CC, 2 n=18), has a complex genome. More than 10% of the assembled sequences, most of which belong to the C subgenome, have not been anchored to the corresponding chromosome. Previously, a complete set of monosomic alien addition lines(MAALs, C1–C9) with each of the nine C-subgenome chromosomes added to the extracted A subgenome was obtained from the allotetraploid B. napus donor Oro, after the ancestral B. rapa(RBR Oro) genome was restored. These MAALs effectively reduced the complexity of the B. napus genome. Here, we determined the expression values of genes on unanchored scaffolds in the MAALs and RBR Oro. Then, multiple comparisons of these gene expression values were used to determine the affiliations of the nonanchored scaffolds on which the genes were located. In total, 54.68%(44.11 Mb) of the 80.67 Mb of non-anchored scaffolds belonging to the C subgenome were assigned to corresponding C chromosomes. This work highlights the potential value of these MAALs in improving the genome quality of B. napus.     

发情周期不同阶段绵羊卵巢lncRNA的鉴定和功能分析

旨在分析不同繁殖周期绵羊卵巢组织中长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,了解lncRNA表达及其调控机理,为绵羊繁育研究提供理论依据。本研究以湖羊为研究对象,选取年龄在1.5～2.5岁的黄体期和卵泡期母羊各3只,通过高通量测序筛选出卵巢组织中的lncRNA,运用生物信息学分析对差异表达的lncRNA进行靶基因预测,通过GO和KEGG富集分析找出与绵羊繁殖相关的通路。结果显示,本研究共获得1 379个差异表达的lncRNAs,其中1 158个表达上调,221个表达下调。GO和KEGG富集分析表明,差异表达的lncRNAs及其靶基因主要参与卵泡发育、排卵周期过程、钙离子信号通路、卵母细胞减数分裂、催产素信号通路、MAPK信号通路、甲状腺激素合成通路、雌激素信号通路。关键的lncRNAs可能通过调控参与这些信号通路和生物学过程的相关基因来调控生殖。其中,LNC_011239、LNC_012847、LNC_003902、LNC_003906、LNC_003907等靶向的MAPK1、ADCY1、ADCY5、PPP3CA和CDC23可能发挥关键的调控作用。qRT-PCR验证证明,随机选取的5个差异lncRNAs定量结果与测序结果基本一致。本研究利用RNA-Seq技术筛选出黄体期和卵泡期卵巢组织中的lncRNAs,并进行差异分析,为揭示绵羊繁殖能力的分子机制提供依据。     

云南独龙鸡和白来航鸡卵巢组织转录组水平的比较分析

旨在利用RNA-seq技术筛选和分析云南独龙鸡和白来航鸡卵巢组织的差异表达基因,为独龙鸡后续基因功能、品种改良和种质特性等研究奠定基础。本研究采集了3只43周龄健康状况良好的独龙鸡卵巢组织进行转录组测序,并与相似饲养条件和周龄的白来航鸡卵巢组织进行比较。结果表明,与白来航鸡相比,独龙鸡中共有1 273个差异表达基因,其中上调基因522个,下调基因751个。GO和KEGG富集分析显示,差异表达基因主要参与蛋白水解、翻译、细胞外泌体、膜组分、结合和催化等过程,在蛋白合成、ECM-受体相互作用、氧化磷酸化、粘着斑等通路中起到重要作用。对显著性通路分析发现独龙鸡在蛋品质和免疫抗性上具有一定优势,但在产蛋性能上与白来航鸡还存在一定差距。本研究筛选到的RPL22、ATP5I、COX5A、JAKMIP1、CATH2基因主要富集在抗性、产蛋性能和蛋品质相关通路中,可作为重要候选基因进一步深入研究。     

sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下沙门菌的转录组分析

为探明沙门菌(Salmonella)在sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下转录组变化情况。本试验采用HiSeq测序平台对沙门菌LT2菌株及其Hfq敲除株进行高通量测序,通过DESeq2差异分析方法筛选敲除sRNA伴侣蛋白Hfq条件下的差异表达基因,对其进行生物信息学GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。结果显示,对照组和试验组分别得到12 753 534条、8 254 308条Clean Reads。通过DESeq2差异分析获得差异基因1 055个,其中表达上调基因516个,表达下调基因539个。GO功能显著性富集分析表明显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、碳水化合物代谢过程等生物过程中。Pathway显著性富集分析表明显著差异表达基因富集到细菌趋化性、丙酸代谢和碳代谢等11个信号通路中。结果表明,本试验应用RNA-seq技术丰富了sRNA伴侣蛋白Hfq调控基因数量,筛选出20个受伴侣蛋白Hfq调控的显著差异表达基因,其中4个基因功能及编码蛋白未知,注释了差异表达基因的生物学功能及信号通路,推断Hfq在细菌对数期主要通过影响营养提供和趋化性等途径,继而影响细菌的正常生理活动,为Hfq协同sRNA的调控机理研究及sRNA靶基因的筛选奠定了基础。     

犏牛雄性不育相关lncRNA的鉴定与分析

旨在分析成年健康牦牛和犏牛(3～4岁)睾丸组织中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,从而探究lncRNA与犏牛雄性不育机制的关联性,为解释犏牛雄性不育的机理提供理论依据。采集成年(3～4岁)健康牦牛、犏牛各3头的睾丸组织,构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选出差异的lncRNA,通过对差异显著的lncRNA与mRNA位置关系以及结合能的判定预测顺式作用(cis)和反式作用(tran)的靶基因,并进行GO、KEGG功能分析。结果表明,共得到牦牛和犏牛候选lncRNA转录本分别为20 363和24 133个,两个文库筛选出6 178个显著差异lncRNA,其中有2 470个在犏牛睾丸组织与牦牛比较上调,3 708个下调。筛选得到差异显著lncRNA的候选靶基因2 676个,这些基因参与58个功能分类,共涉及306条通路;其中主要富集的通路包括轴突指导、内吞、Hedgehog等信号通路。综上表明,部分lncRNA介导的靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11与犏牛雄性不育相关,lncRNA在犏牛的生殖发育中对其雄性不育具有重要的调控作用。利用RNA-Seq技术筛选出成年牦牛和犏牛睾丸组织lncRNA,并进行差异分析,为探讨犏牛雄性不育的机制提供更完善的转录组数据。