坛紫菜有丝分裂阻滞缺陷蛋白2基因(Ph-mad2)的克隆及其在单性生殖过程中的表达

为探究坛紫菜雌配子体单性生殖过程的细胞二倍化机制,实验基于坛紫菜雌性配子体的转录组信息,克隆和分析了坛紫菜的有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(PhMAD2)基因(Phmad2),同时对其在坛紫菜单性生殖发生过程中处于不同发育时期的细胞中的表达特征进行了初步研究。结果显示,坛紫菜Ph-mad2基因的cDNA的完整开放阅读框为672 bp,编码223个氨基酸,分子量为23.8 ku。从氨基酸序列比对结果可知,坛紫菜PhMAD2蛋白中所具有的典型的HORMA结构域和保守的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点,均与团藻和莱茵衣藻MAD2蛋白相同。系统发育分析表明,坛紫菜与藻状菌纲的异丝水霉和寄生水霉的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测显示,与可进行正常有丝分裂的营养细胞相比,在坛紫菜单性生殖过程中发生细胞二倍化的生殖细胞和单性孢子时期,Ph-mad2基因的表达量显著下降;但是,在随后可进行正常有丝分裂的单性孢子萌发体细胞和处于营养生长期的单性孢子体细胞中则表达上调。这一结果暗示Ph-mad2基因的表达下调可能阻碍了坛紫菜单性生殖初期单倍体细胞进行有丝分裂时纺锤体组装检验点的形成,在一定程度上致使它们发生了染色体加倍。     

坛紫菜薄叶新品系选育及经济性状的比较

对坛紫菜人工杂交和选育的Z-26、Z-61和Z-81品系的F2、F3代的经济性状进行比较,旨在选育优良的薄叶新品系。实验结果表明,（1）Z-61新品系藻体薄,厚度约为26～32μm,培养期间经两次剪收,厚度增长不明显,日平均增厚0.32～0.35μm/d;Z-81藻体厚度为36～40μm,比Z-61厚38～50%,剪收后厚度增长明显,日平均增厚0.60～0.70μm/d,经两次剪收后藻体厚度可达52μm;Z-26新品系厚度为30～42μm,剪收后厚度日增长介于Z-61和Z-81新品系之间,为0.37～0.55μm/d;（2）Z-61的F3代在低氮、磷培育液培养8d,藻体虽然发黄但未死亡,移至含有氮、磷的正常培养液中培养2～3d,色泽和生长均可恢复正常;Z-81F3代和Z-26F3代在低氮、磷下生长较Z-61F3代慢,恢复时间需要3～5d;（3）Z-61F2代第1次剪收时的藻胆蛋白含量较Z-26、Z-81品系高30.2%～34.4%,叶绿素a含量比Z-81高13.8%～44.7%。以上研究结果可为选育薄叶型坛紫菜,提高坛紫菜的质量和经济效益奠定基础。     

Floridean Starch and Floridoside Metabolic Pathways of Neoporphyra haitanensis and Their Regulatory Mechanism under Continuous Darkness

Floridean starch and floridoside are the main storage carbohydrates of red algae. However, their complete metabolic pathways and the origin, function, and regulatory mechanism of their pathway genes have not been fully elucidated. In this study, we identified their metabolic pathway genes and analyzed the changes in related gene expression and metabolite content in Neoporphyra haitanensis under continuous dark conditions. Our results showed that genes from different sources, including eukaryotic hosts, cyanobacteria, and bacteria, were combined to construct floridean starch and floridoside metabolic pathways in N. haitanensis. Moreover, compared with those in the control, under continuous dark conditions, floridean starch biosynthesis genes and some degradation genes were significantly upregulated with no significant change in floridean starch content, whereas floridoside degradation genes were significantly upregulated with a significant decrease in floridoside content. This implies that floridean starch content is maintained but floridoside is consumed in N. haitanensis under dark conditions. This study elucidates the “floridean starch–floridoside” metabolic network and its gene origins in N. haitanensis for the first time.     

基因条码在条斑紫菜(Pyropia yezoensis)不同品系间种质鉴定中的适用性

为寻找适宜的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)品系间种质分子标记鉴定法,利用4种基因条码(RUBISCO Spacer、UPA、Cox2-3和ITS-5.8S)对产自中国和日本的6个条斑紫菜品系的亲缘关系进行了分析研究.结果显示,在6个条斑紫菜品系中,上述4种基因条码的序列同源性较高,同源性为97.8％-100％,其中,RUBISCO Spacer序列的同源性为100％.UPA序列的同源性分析结果显示,在中国产的LS、B4、HT和TM18品系中,该序列完全相同,但与日本产的GT和ROS-2两个品系的序列有差异,该序列的同源性为99.2％.在6个品系中,Cox2-3和ITS-5.8S序列的同源性相对较低,分别为97.8％-99.2％和98.4％-99.8％.根据UPA、Cox2-3和ITS-5.8S基因条码通过邻接法构建的系统进化树显示,依据ITS-5.8S和UPA序列均能分别区分中国产的4个品系(LS、B4、HT和TM18)与日本产的两个品系(GT和ROS-2),分别形成两个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系一致.但利用ITS-5.8S序列均能对中国产的4个品系和日本产的两个品系进行再区分,而利用UPA序列却无法对中国产的4个品系进行再区分,只能区分日本产的两个品系.使用Cox2-3序列则将GT、ROS-2、LS和TM18这4个品系聚成一个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系不一致.上述结果说明,利用ITS-5.8S序列对本研究的6个条斑紫菜品系进行种质鉴定,效果最好.     

响应面法优化末水坛紫菜蛋白酶解工艺及其酶解液抗氧化活性研究

为实现末水坛紫菜(Porphyra haitanensis)的高值化利用,研究了末水坛紫菜的蛋白酶解工艺及其酶解液的抗氧化活性。以酶解产物水解度和还原力为指标,分别采用单因素和响应面优化实验筛选出最适蛋白酶和最佳酶解工艺参数;通过测定酶解液还原力对1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O_2^-·)的清除作用,研究了最高水解度下的酶解液的抗氧化性活性。结果表明,中性蛋白酶是6种蛋白酶中的最适用酶;最佳酶解条件为:底物质量浓度35 g·L^-1、加酶量31 200 U·g^-1、温度45℃、pH 7.6、酶解时间5 h,在此条件下坛紫菜水解度达31.37%;酶解液还原力为2.2,对DPPH、·OH和O_2^-·自由基清除率分别为56.26%、85.84%和72.73%。结果表明,中性蛋白酶可以有效水解末水坛紫菜,水解后的酶解产物具有较好的抗氧化能力和应用前景。     

坛紫菜叶状体RNA提取方法的改良与比较

为提取高质量的坛紫菜叶状体总RNA,对常用的几种植物RNA提取方法(CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法)按照去除多糖、多酚的方法进行了改良,并对分离的总RNA根据吸光值、电泳图谱及RT-PCR检测等结果与两种试剂盒(离心柱试剂盒法,RNAiso法)的提取结果进行了比较。结果表明,SDS法、异硫氰酸胍法和RNAiso法3种方法提取的RNA纯度低,质量差,部分RNA已经发生了降解。而改良CTAB法和离心柱试剂盒法提取的总RNA质量可靠,完整性好,纯度高,并且成功去除了可能影响逆转录酶活性的物质,可以进一步应用于cDNA文库构建,基因表达分析等后续实验,但这两种方法各有优缺点,应根据实际情况选用合适方法进行坛紫菜叶状体总RNA的分离。     

坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540);PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。     

福鼎敏灶湾2012年坛紫菜烂菜原因初探

对2012年10月福鼎敏灶湾海区坛紫菜烂菜情况进行采样、调查和原因分析。结果显示坛紫菜烂菜症状主要为叶状体梢部颜色变红,部分藻体颜色变淡、发白,烂化甚至脱落。烂菜原因主要有：（1）高温小潮期,海面风力小、浪静,由波浪形成的海水垂直流动交换弱,藻体与海水中的二氧化碳和营养盐等微交换也随之变弱,从而导致坛紫菜细胞生理机能下降;（2）坛紫菜养殖过密,海水中含氮量偏低,使得坛紫菜生长受限制;（3）南侧近岸海域水流不畅、流速较缓,悬浮物等污染物质积聚于该海域,易粘附于坛紫菜叶状体,影响坛紫菜的生长。为此作者提出防范建议旨在为今后福建省坛紫菜健康养殖可持续发展提供参考意见。     

坛紫菜品系间杂交分离色素突变体及其特性的初步研究

以野生选育的坛紫菜(Porphyra haitanensis)为母本,诱变选育全棕红的品系为父本进行杂交实验,从杂交子代大量叶片中,筛选出1株褐黄色素突变体、1株翠绿色与野生色相嵌的嵌合体和1株褐绿色与野生色相嵌的嵌合体。通过酶法分离突变体的营养细胞,单性生殖获得丝状体;分别使丝状体成熟并放散壳孢子,然后单株培养和筛选获得褐黄、翠绿和褐绿色子代叶状体。实验进行50 d。结果:(1)褐黄色突变体藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量低;孢子囊枝的细胞较小,且大量形成时间比亲本晚15 d;幼苗培养初期日平均生长量仅为(1.22±0.28)cm,当叶片长到60 cm左右时生长优势逐步凸显,日平均生长量可达(7.50±1.18)cm;(2)翠绿色丝状体容易成熟,发育方式特殊,营养藻丝不经过藻丝加粗阶段,直接由球形细胞发育成孢子囊枝和壳孢子囊;翠绿色叶状体藻红蛋白含量低,仅有(5.513 0±1.049 6)mg/g(干品);叶状体生长快速,60 cm长的藻体日平均生长量高达(11.95±2.33)cm;(3)褐绿色突变体藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白这3种色素蛋白和叶绿素的含量均较低;藻丝细胞短且细,叶状体生长速度较慢。     

条斑紫菜耐高温杂交重组品系的筛选与特性分析

为改善条斑紫菜优良品系TM-18藻体颜色偏红的弱点,本研究以红色型突变品系(TM-18,特点:藻体偏红色;生长快,色素蛋白含量高,具有一定的耐高温性)为父本;绿色型突变品系(OMO-1,特点:藻体绿色,生长较慢,色素蛋白含量低,耐高温性差)为母本进行种内杂交,从杂合丝状体的F1叶状体中,分离出了优良品系TW-9。通过比较它与亲本品系的特性,获得以下结果:在常温(18°C)和高温(24和25°C)下培养13 d,TW-9品系的壳孢子存活率分别为TM-18品系的1.0、1.1和1.1倍,以及OMO-1品系的1.1、4.7和7.2倍。在18°C组,3个品系的壳孢子苗畸形率无显著性差异,但在24和25°C组,TW-9品系的畸形苗率比TM-18品系分别降低了20.3%和29.5%,比OMO-1品系分别降低了74.8%和69.5%。将在18°C下培养40 d的叶状体分别置于18、24和25°C再培养10 d,TW-9品系的绝对生长率分别为TM-18品系的0.9、1.5和0.8倍,以及OMO-1品系的1.4、1.5和28倍。此外,在24°C下培养25 d或在25°C下培养10 d,OMO-1品系的藻体腐烂严重,最后完全解体;TM-18和TW-9品系藻体在24°C下培养25 d只出现轻微卷曲,但在25°C下,TM-18品系培养15 d就腐烂至完全解体,而TW-9品系培养30 d也只是轻微腐烂。在18°C下培养40 d的TW-9品系叶状体分别再在18和24°C下培养15 d,总藻胆蛋白含量分别为61.5和77.8 mg/g,分别为OMO-1品系的1.4和1.4倍,但与TM-18品系的含量相比无明显差异。在18°C下培养55 d的叶状体平均厚度,TW-9品系为25.6μm,分别比TM-18和OMO-1品系降低了13.5%和17.7%。另外,3个品系的壳孢子放散量无显著性差异。研究表明,TW-9品系不仅具有与TM-18品系相似的特性,如叶状体生长快、色素蛋白含量高、壳孢子放散量大等特性,并且它的藻体更薄、更耐高温,其颜色与野生色相近,符合生产栽培的要求,有望被培育成适宜栽培的新品种。