微卫星标记在坛紫菜丝状体品系DNA指纹构建中的应用

用从条斑紫菜EST数据库中筛选合成的微卫星引物对8个坛紫菜丝状体品系进行微卫星DNA指纹扩增。5个微卫星引物共扩增出32条带,其中3对引物所扩增出的5个条带(AU192094—127、AU187410—335、AU187410—190、AU194267—203和AU194267—328)被用来构建8个坛紫菜丝状体品系的DNA指纹。在这个图谱中,每个丝状体品系都有独一的指纹模式,彼此很容易被区分开。所获得的DNA指纹图谱,可用来进行孟德尔分离研究,及为坛紫菜纯系鉴定提供分子基础。     

坛紫菜甲醇提取物屏蔽紫外能力的研究

分别用浓度为80%,90%和100%的甲醇提取坛紫菜的天然防晒物质,分析其紫外吸收能力和抗氧化能力。结果表明,采用80%的甲醇对坛紫菜进行提取的效果最好。坛紫菜的MAAs粗提物在紫外波段(ultraviolet radiation,UVR,280～400 nm)具有明显的吸收峰,说明该提取物具有良好的紫外吸收能力。将MAAs粗提物与市购防晒乳霜(自然堂,SPF18)分别按质量比为1∶30,1∶20,1∶10和1∶5的比例混合后,MAAs粗提物可以显著改良市购防晒乳霜的抗紫外能力,其防晒系数(SPF,sun protection factor)分别增大到22,43,87和114。MAAs粗提物对DPPH和羟自由基的清除率分别为12.82%和0.58%。因此,MAAs粗提物可作为功效成分添加剂应用于防晒化妆品中。     

多个条斑紫菜品系采收期内脂肪酸组成、含量的变化分析

为探讨条斑紫菜不同栽培品系、不同采收期脂肪酸组成及含量的变化,本实验对10个栽培品系进行了跟踪测定分析,结果显示:条斑紫菜的脂肪酸组成稳定,与品系、采收期内季节性变化无关,但含量存在明显的差异。各品系的3个采收期的饱和脂肪酸(16∶0为主,包括13∶0、16∶0、18∶0)的相对含量约为20%;不饱和脂肪酸(以EPA为主,包括18∶1 n-9、18∶2 n-6、18∶3 n-3、20∶1 n-9、20∶2 n-7、20∶3 n-7、20∶4 n-6(AA)、20∶5 n-3(EPA))的相对含量为70%左右。在温度最低2月份的采收样品中,总脂肪酸和EPA含量最高,显示低温有利于条斑紫菜脂肪酸尤其是EPA的积累。另外,条斑紫菜富含以EPA为主的不饱和脂肪酸,在整个采收期内,样品中的n-6/n-3比值为4.9～7.7,符合WHO/FAO膳食推荐值。     

自然条件下的坛紫菜（Pyropia haitanensis）四分体发育与性别表型观察

为探明野生坛紫菜的性别真相以及野外的性别观察与室内遗传杂交实验所得性别结果相反的原因,对可能影响天然坛紫菜性别的几个关键问题进行了研究。结果发现,5.8S rDNA保守区域的序列分析结果证实,野生坛紫菜群体中的雌雄同体与雌雄异体个体均属同一物种。坛紫菜颜色突变体与野生型间的杂交品系在天然条件下栽培所产生的F1叶状体出现了亲本色的分离与重组,95.6%的小叶状体(约5 mm)为由2～4色块构成的颜色嵌合体,它们长大后的每个色块只出现一种性别,颜色嵌合体也是性别嵌合体,该结果与室内杂交实验一致,这表明在自然条件下,坛紫菜的减数分裂位置与性别分离模式均未改变。但在随后的发育过程中,近基部的1～2个色块严重滞育,仅形成肉眼较难发现的小藻块,构成假根和基部,它们基本不成熟,造成嵌合体的绝大部分藻体由梢部的1～2个色块发育而来,嵌合体比例降至42.1%。但即使是雌雄嵌合的个体,由于梢部色块面积通常较大且成熟远早于中、基部色块,在成熟期的初、中期,成熟个体几乎均为梢部色块成熟,表现为单性,在成熟期的晚期,中部色块开始成熟,雌雄同体比例大幅度上升。本研究表明,在天然条件下生长的坛紫菜仍以雌雄同体为主,但减数分裂产物的四分体不均衡发育以及藻体的梢、中、基部的不同步成熟均极大地降低了叶状体真实性别被观察到的概率,单凭肉眼一次性抽检,其性别往往以雌雄异体为主,少数为雌雄同体。     

坛紫菜藻红蛋白粗提技术的研究

[目的]快速、有效、大批量地提取藻红蛋白。[方法]以坛紫菜为原料,采用溶胀法、化学试剂法和搅切法3种粗提技术,以藻红蛋白的提取得率、纯度和提取时间为参数对3种方法进行比较。[结果]溶胀法采用0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）浸提9h,藻红蛋白得率为9.71mg/g,纯度（A565/A280）为0.45;化学试剂法在0.100mol/LSDS溶液作用4h时,藻红蛋白得率为24.35mg/g,纯度（A565/A280）为0.22左右;搅切法采用搅切速度18000r/min作用6min,藻红蛋白得率达到23.11mg/g,纯度（A565/A280）为0.30。[结论]综合比较,搅切法提取藻红蛋白效率高,藻红蛋白得率和纯度较好,处理量较大,是一种十分有效的粗提方法。     

Characterization of ACE Inhibitory Peptides Prepared from Pyropia pseudolinearis Protein

More than 7000 red algae species have been classified. Although most of them are underused, they are a protein-rich marine resource. The hydrolysates of red algal proteins are good candidates for the inhibition of the angiotensin-I-converting enzyme (ACE). The ACE is one of the key factors for cardiovascular disease, and the inhibition of ACE activity is related to the prevention of high blood pressure. To better understand the relationship between the hydrolysates of red algal proteins and the inhibition of ACE activity, we attempted to identify novel ACE inhibitory peptides from Pyropia pseudolinearis. We prepared water soluble proteins (WSP) containing phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, and ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. In vitro analysis showed that the thermolysin hydrolysate of the WSP had high ACE inhibitory activity compared to that of WSP. We then identified 42 peptides in the hydrolysate by high-performance liquid chromatography and mass spectrometry. Among 42 peptides, 23 peptides were found in chloroplast proteins. We then synthesized the uncharacterized peptides ARY, YLR, and LRM and measured the ACE inhibitory activity. LRM showed a low IC₅₀ value (0.15 μmol) compared to ARY and YLR (1.3 and 5.8 μmol). In silico analysis revealed that the LRM sequence was conserved in cpcA from Bangiales and Florideophyceae, indicating that the novel ACE inhibitory peptide LRM was highly conserved in red algae.     

坛紫菜耐低氮磷品系选育的研究

在含氮量仅为海区的1／100、含磷量仅为海区的1／15的低氮、磷环境下,对人工选育和建立纯系的坛紫菜褐绿色、红棕色品系3代叶状体（F1、F2、F3）的耐受力情况及生长情况进行研究,发现2个品系的藻体均具有极强的耐低氮、磷能力：1）褐绿色藻体在低氮、磷环境下培养21d才停止生长,叶片无成熟现象,仅轻微的腐烂和萎缩．3～4cm长的藻体培养7～9d时的长度日生长量是对照组的4．73倍,鲜重日增重率是对照组的5．29倍;培养18～21d时的长度日生长量为（0．86±0．27）cm,鲜重日增重率为（5．32±0．21）％．褐绿色品系F3代的平均长度比对照组长28．7cm．2）红棕色藻体在相同条件下培养15d后停止生长,叶片无成熟、腐烂和萎缩,3代叶状体在低氮、磷甚至无氮、磷环境下的耐受力和生长状况均比较稳定且有所提高,遗传性状比较稳定．3～4cm长的红棕色藻体在低氮、磷环境下培养7～9d时的长度日生长量是对照组的4．95倍,鲜重日增重率是对照组的3．58倍;培养13～15d时藻体的长度日生长量为（1．92±0．53）cm,鲜重日增重率为（13．61±0．46）％．F3代的平均长度比对照组长23．16cm．3）通过选育可以看出褐绿色品系比较耐低氮、磷,该品系可以较好地解决养殖过程中低氮、磷环境对于紫菜养殖所造成的危害,缓解由于养殖密度过大而造成的病害发生和减产、减收现象．     

坛紫菜杂交品系优势的初步评价

通过坛紫菜诱变选育品系和野生选育品系间杂交,筛选出了4个经济性状优良的杂交品系(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ);杂交品系的子代表现出较大的杂交优势,既具有亲本优势,又具有超亲优势;品系Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的3～5cm幼苗经过10d培育,平均日增重量的超标优势分别达12.35%、139.78%、107.57%和173.52%;杂种优势指数达99.83%、213.07%、184.44%和243.05%;品系Ⅱ耐高温能力较强,在29℃水温中可正常生存10d以上;品系Ⅲ在4个杂交品系中生长最快,培育20d时藻体的平均长度是父本的1.29倍,总藻胆蛋白含量最高,达(103.83±0.49)mg/g干品;品系Ⅳ和Ⅴ藻体宽而薄,不易腐烂和老化,其中品系Ⅳ叶绿素含量高达(9.79±0.48)mg/g干品,比母本高46.21;从杂交品系的性状稳定性来看,品系Ⅱ的F2和F3叶状体长度生长相对稳定,品系Ⅲ的F3叶状体经过选育后,生长性能比F2叶状体更加突出。和F2叶状体相比,品系Ⅳ的F3各项指标表现出较大的稳定性。本研究为坛紫菜杂交育种的应用积累了有用资料。     

Optimization of Porphyran Extraction from Pyropia yezoensis by Response Surface Methodology and Its Lipid-Lowering Effects

Macroalgae polysaccharides are phytochemicals that are beneficial to human health. In this study, response surface methodology was applied to optimize the extraction procedure of Pyropia yezoensis porphyran (PYP). The optimum extraction parameters were: 100 °C (temperature), 120 min (time), and 29.32 mL/g (liquid–solid ratio), and the maximum yield of PYP was 22.15 ± 0.55%. The physicochemical characteristics of PPYP, purified from PYP, were analyzed, along with its lipid-lowering effect, using HepG2 cells and Drosophila melanogaster larvae. PPYP was a β-type sulfated hetero-rhamno-galactan-pyranose with a molecular weight of 151.6 kDa and a rhamnose-to-galactose molar ratio of 1:5.3. The results demonstrated that PPYP significantly reduced the triglyceride content in palmitic acid (PA)-induced HepG2 cells and high-sucrose-fed D. melanogaster larvae by regulating the expression of lipid metabolism-related genes, reducing lipogenesis and increasing fatty acid β-oxidation. To summarize, PPYP can lower lipid levels in HepG2 cells and larval fat body (the functional homolog tissue of the human liver), suggesting that PPYP may be administered as a potential marine lipid-lowering drug.     

坛紫菜有丝分裂阻滞缺陷蛋白2基因(Ph-mad2)的克隆及其在单性生殖过程中的表达

为探究坛紫菜雌配子体单性生殖过程的细胞二倍化机制,实验基于坛紫菜雌性配子体的转录组信息,克隆和分析了坛紫菜的有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(PhMAD2)基因(Phmad2),同时对其在坛紫菜单性生殖发生过程中处于不同发育时期的细胞中的表达特征进行了初步研究。结果显示,坛紫菜Ph-mad2基因的cDNA的完整开放阅读框为672 bp,编码223个氨基酸,分子量为23.8 ku。从氨基酸序列比对结果可知,坛紫菜PhMAD2蛋白中所具有的典型的HORMA结构域和保守的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点,均与团藻和莱茵衣藻MAD2蛋白相同。系统发育分析表明,坛紫菜与藻状菌纲的异丝水霉和寄生水霉的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测显示,与可进行正常有丝分裂的营养细胞相比,在坛紫菜单性生殖过程中发生细胞二倍化的生殖细胞和单性孢子时期,Ph-mad2基因的表达量显著下降;但是,在随后可进行正常有丝分裂的单性孢子萌发体细胞和处于营养生长期的单性孢子体细胞中则表达上调。这一结果暗示Ph-mad2基因的表达下调可能阻碍了坛紫菜单性生殖初期单倍体细胞进行有丝分裂时纺锤体组装检验点的形成,在一定程度上致使它们发生了染色体加倍。