坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

坛紫菜“申福2号”的SSR分子标记

利用微卫星(SSR)分子标记技术, 对坛紫菜(Porphyra haitanensis)优良品系“申福2号”的丝状体和叶状体分别进行了特异性分子标记鉴定, 结果发现: 用9^#引物(序列为F: TCACAATGGGTGATATGGC; R: CCACAT TTAAGTCCGACTCTG) 对“申福2号”丝状体的DNA进行扩增, 出现了能区别于其他14个品系(6个优良品系, 3个杂交品系, 5个野生品系)的特异性条带。用该引物对室内培养的“申福2号”叶状体的DNA进行扩增, 也均获得了与丝状体相同的特异性条带。此外, 用该引物分别对栽培在不同海区和不同时期采收的“申福2号”叶状体进行验证, 结果均出现了与丝状体相同的特异性条带。该特异性条带的DNA测序结果证实, 9^#引物产生的SSR标记反映了微卫星DNA重复序列的变化。通过SSR Hunter软件搜索到了设计引物时的核心序列, 所得产物大小在预期长度范围内, 是特异性扩增。通过BLAST比对得知, 该序列在核酸数据库中没有同源序列, 是一个新序列。通过DNAMAN软件分析得知, “申福2号”、“申福1号”之间序列差异较小, 与坛紫菜霞浦野生种差异较大。这证实该标记反映的是种内品系间的差异, 可以用于种内品系鉴定。上述结果表明, 由9^#引物扩增出的这一特异性条带可以认为是“申福2号”丝状体和叶状体的特异性标记, 可用于该品系的种质鉴定。

     

二氧化碳和阳光紫外辐射对坛紫菜丝状体光合生理特性的影响

为了探索大型海藻生活史丝状体阶段对于海洋酸化与紫外辐射的响应,实验选取经济海藻坛紫菜的自由丝状体作为实验材料。实验设置两个CO2浓度,正常CO2浓度(390 ppmv)和高CO2浓度(1 000 ppmv);3种辐射处理,PAR处理(仅接受可见光)、PA处理(滤除UV-B)、PAB处理(全波长辐射)。研究结果表明,高CO2显著提高了坛紫菜自由丝状体的生长速率,但高CO2处理下坛紫菜自由丝状体中藻红蛋白、藻蓝蛋白、叶绿素a、类胡萝卜素及紫外吸收物质UVACs分别降低了7.3%、9.3%、19.8%、16.5%和18.7%。高CO2处理的坛紫菜自由丝状体最大光化学效率Fv/Fm,光能利用效率(α)及最大相对电子传递速率(rETRmax)都显著高于正常CO2处理。太阳模拟器下处理的坛紫菜自由丝状体,PAR与PA处理下的抑制率,正常CO2与高CO2处理间无显著差异,然而在PAB处理下,高CO2处理的抑制率要高于正常CO2处理,这可能与其体内紫外吸收物质含量下降有关。PAR处理下的抑制率,无论是在正常CO2还是在高CO2处理下,都显著低于PA及PAB处理,而PA与PAB之间无显著差异。在未来海洋持续酸化的背景下,UV辐射的增加将会影响到坛紫菜自由丝状体的光合生理及生长。     

紫菜叶状体的红烂病研究

从福建省平潭岛野生坛紫菜群体中发现有患细菌性红烂病的叶状体,从患病的叶状体上分离得到病原细菌一株,经16S rDNA序列分析发现其与细菌域海螺菌目(Oceanospirillales)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、Cobetia属的海科贝特菌(Cobetia marina)的相似度达100%。病原细菌经液体培养基扩大培养后,将适量的菌液接种到不同种紫菜和坛紫菜不同品系的叶状体圆盘块上进行人工回复感染试验以确定其感染特性。结果发现该病原细菌能感染健康野生坛紫菜且出现的病症与海区患病坛紫菜相同,且该病原细菌对不同种紫菜(坛紫菜、条斑紫菜、未定名紫菜)的叶状体圆盘块和不同品系的坛紫菜(AN-2,YZ-6,JIU-7,ZS-1)叶状体圆盘块均能快速感染,所产生的病症与野生坛紫菜叶状体感染红烂病的症状相同:均出现了铁锈红色的死亡细胞,且同时含有少量被解离的单离细胞。上述结果说明分离到的病原细菌是坛紫菜红烂病的病原细菌,可以快速感染各种不同的紫菜叶状体。     

福建坛紫菜赤腐病的病程及病原鉴定

于2011年10月-2012年2月,对福建省福鼎市、霞浦县、泉州市和晋江市等海区发生的坛紫菜腐烂病害进行了研究.通过观察发病特征以及镜检,详细记录了该病害的侵染过程,并在发病组织中观察到双鞭毛游动孢子以及孢子囊、雄器和藏卵器等重要结构特征,病菌形态与条斑紫菜上的紫菜腐霉相似;利用半海水玉米琼脂培养基分离提纯该病菌,命名为FM1.经感染试验证实,FM1引起的发病症状与自然海区患病紫菜的症状一致,说明FM1为致病菌.通过扩增该菌核糖体DNA ITS序列,并构建基于ITS+5.8S序列的N-J系统发育树,结果显示FM1菌株与紫菜腐霉的ITS区相似度很高,达到99%.综合形态学及ITS序列分析确定,紫菜腐霉是导致此次病烂的主要病原菌,该病原菌引起的病害称为"赤腐病".     

甲胺磷、辛硫磷对坛紫菜叶状体的生理效应

In this paper, the effects of methmidophos and phoxim with different concentrations and schedule on soluble protein content and chlorophyl a (Chla) content in Porphyra haintanensis were studied under experimental and ecological conditions. The results showed as follows: (1) there were some time-effect and dose-effect relationships between the pollutants and Chla contents. The Chla content of most of groups decreased with the increasing of dose and prolonging of the exposure time. In the same concentration, the toxicities of phoxim to Chla content was stronger than that of methmidophos. (2) All concentration groups in this study didn‘t show the significant time-effect and dose-effect relationships between pollutants and the soluble protein. And there was no significant difference of the soluble protein content among various groups.     

坛紫菜体细胞单克隆叶状体途径及海上养殖

用海螺酶酶解坛紫菜叶状体制备游离的营养细胞,在显做镜下挑选出单个细胞放入96孔板,在20℃,1500～2000 lx,12D:12L条件下进行隔离培养。一部分细胞直接发育形成了叶状体:一种途径是单个细胞通过典型的两级分裂发育成叶状体,也有一些单细胞先形成叶片状的细胞团,然后在细胞团一端形成假根;另一种途径是部分单细胞先形成“愈伤组织”,经过一段时间培养后放散出类似“孢子”的细胞,其中部分“孢子”发育成叶状体。由单细胞克隆培养获得的叶状体经组织培养形成纯合丝状体,这种纯系丝状体扩大培养后转入传统的育苗途径下海养殖。纯系在苗网附着率、叶片质量和性成熟时间等经济性状方面比未经选育的普通种有优势。     

条斑紫菜中无机砷含量及海区环境痕量砷的分析

通过分析我国条斑紫菜主产区紫菜产品中无机砷、栽培海区海水、沉积物中总砷含量在整个生产周期中的变化情况,初步探讨栽培海区环境中砷含量与条斑紫菜中砷含量的关系。于2012-2013年紫菜栽培季节,按实际生产的采收批次,分别采收条斑紫菜原藻、加工品,对样品中的无机砷含量进行测定与分析,并对栽培海区的海水及表层沉积物中总砷进行定量检测与分析。结果显示,江苏省条斑紫菜原藻样品中无机砷含量为0.22~0.70mg/kg,加工品中无机砷含量为0.12~0.32 mg/kg,原藻及加工品中的无机砷含量随生产阶段的推后呈下降趋势,完全符合国家食品安全限量标准;栽培海区海水总砷含量为0.000 83~0.004 91mg/L,在整个生产周期都低于国家养殖用水水质标准对砷的限量要求,栽培海区海水中的总砷与当地紫菜产品中的无机砷之间总体呈正相关关系;表层沉积物中总砷含量范围为15.435~58.900μg/g,与条斑紫菜中无机砷含量没有明显的相关性。     

用人工海水培养坛紫菜的初步研究

用天然海水与海水晶配置成的人工海水按10∶0,8∶2,6∶4,4∶6,2∶8,0∶10的体积比配成6种不同的培养液,用它们培养野生型坛紫菜叶状体。培养30 d后,叶状体的生长情况如下:在100%天然海水中培养的坛紫菜叶状体生长最快,其它组的生长快慢依次为:含20%>40%>60%>80%的海水晶人工海水组。在100%海水晶人工海水组培养的叶状体5 d后死亡。叶状体叶绿素a(Chl.a)含量在20%海水晶人工海水组中最高,其余各组的含量相差不大,但藻红蛋白(PE)和藻蓝蛋白(PC)含量均比100%天然海水组稍低。用上述6种培养液培养坛紫菜丝状体,结果表明在60%海水晶人工海水组中培养的自由丝状体鲜重增加最明显,生长情况最好,100%天然海水组增重最少,其余各组增重差异不明显。坛紫菜丝状体在100%海水晶人工海水中生长良好,这说明可以用海水晶人工海水来培养坛紫菜丝状体。