三疣梭子蟹“黄选1号”盐度耐受性及适宜生长盐度分析

对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus“黄选1号”群体进行盐度胁迫试验,结果表明:24、48、72 h低盐海水对三疣梭子蟹的半致死浓度分别为5.13、7.49和8.56;24、48、72 h高盐海水的半致死浓度分别为54.49、52.74和52.21;三疣梭子蟹“黄选1号”安全存活盐度为13.7 ～47.7.在三疣梭子蟹安全存活盐度范围内设置6个盐度梯度,分别为18.7、23.7、28.7、33.7(自然海水对照组)、38.7和43.7,在不同盐度梯度下对80日龄三疣梭子蟹“黄选1号”进行40 d的养殖试验,结果表明:各盐度组三疣梭子蟹的存活率分别为60％、59％、63％、49％、48％和38％;低盐组(18.7、23.7、28.7)的存活率、增重率和蜕皮速度均比高盐组(33.7、38.7和43.7)好且差异显著(P＜0.05).综合比较表明,三疣梭子蟹“黄选1号”生长的最适宜盐度为28.7.     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)两种养殖塘水体古菌的季节变化

结合基于古菌16S rRNA 基因的末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术与克隆测序技术对象山港三疣梭子蟹–脊尾白虾混养模式下改良塘 M1(塘底铺网、四周铺砂的养殖塘)以及传统塘M2(土塘)不同季节水体古菌群落结构和多样性进行分析。结果显示,M1、M2养殖塘水体古菌群落均由泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)组成。M1、M2水体古菌群落组成在养殖初期较相似,但随着养殖时间的推移,古菌群落结构组成发生显著差异。M2养殖水体古菌群落结构随时间变化的差异性大于 M1,说明 M2养殖生态古菌群落稳定性低于 M1,底铺网、四周铺砂的改良措施可以减少古菌群落变化的幅度。相关性分析发现,多样性指数高时,古菌分布受环境的影响较小;2种养殖塘水体古菌分布受温度、溶解氧、总氮和总磷的影响较大。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因1的克隆及功能鉴定

为丰富三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶基因家族的组成,进行了几丁质酶基因1(PtCht1)的研究。PtCht1基因cDNA全长为2220 bp,编码583个氨基酸。结构域比对发现,PtCht1含有甲壳动物几丁质酶GH18家族基因的基本结构及保守序列,且进化树显示,三疣梭子蟹Cht1与拟穴青蟹(Scylla serrata)等物种的Cht1聚为一类,同源性最高,达92.80%。由此确定,PtCht1为甲壳动物GH18家族Group1基因,也是三疣梭子蟹该分类下的首个基因。此外,全组织表达分析结果显示,PtCht1在肝胰腺中较特异性高表达,且在蜕皮间期的肝胰腺中的表达量显著高于前期和后期(P<0.05)。低盐度胁迫处理后,在肝胰腺中,PtCht1基因的表达量在3 h快速升至峰值,为对照组的2.72倍;在鳃中,除12 h外,PtCht1基因的表达量均呈显著上调表达(P<0.05),最高上调9.96倍。结果表明,PtCht1基因能够参与机体对几丁质类食物的消化过程,并且在渗透压的调控等方面发挥重要作用。本研究可为三疣梭子蟹几丁质酶GH18家族Group1基因的研究奠定基础,为解析盐度影响三疣梭子蟹生长提供参考。     

利用胃磨鉴定三疣梭子蟹年龄初探

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是中国重要的经济物种,对其进行年龄鉴定有利于其种群资源的评估和管理。该研究对三疣梭子蟹的胃磨进行制片处理,初步探讨了胃磨鉴龄的可行性。三疣梭子蟹胃磨由5个部分(前幽门骨、外幽门骨、尾贲门骨、轭贲门骨和翼贲门骨)组成,依据前人研究结果选取外幽门骨和尾贲门骨进行切片观察。结果显示,三疣梭子蟹胃磨微结构由4个部分(蜡质层、外角质层、钙化层和膜层)组成,用于年龄鉴定的生长纹主要存在于钙化层中。利用7个生长方程拟合三疣梭子蟹生物学数据与生长纹数目的关系,结合赤池信息量准则(AIC)得出甲长与甲宽呈线性函数关系、甲宽与体质量呈幂函数关系;体质量与胃磨生长纹数目的关系适用于Gompertz模型,甲长、甲宽与胃磨生长纹数目的关系则更适用于v-B生长模型。即胃磨生长纹可以作为甲壳类年龄鉴定的材料,但由于实验样本偏小型化,后续需要延长时间跨度进一步验证。     

三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原胁迫后的表达特征分析

C-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的重要一员,在细胞增殖、凋亡和免疫应激等过程中发挥着重要作用。为深入研究JNK基因的免疫防御机制,本研究从三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)转录组数据库中筛选到JNK基因的EST序列,利用RACE扩增技术克隆得到该基因全长序列,命名为PtJNK,cDNA全长为3240 bp,开放阅读框(ORF)为1380 bp,编码459个氨基酸,具有TPY磷酸化位点的S_TKC保守结构域,是JNK基因家族典型特征。组织表达分布结果显示,PtJNK基因在所有组织中均有表达;Real-time PCR检测不同病原刺激下PtJNK基因的表达水平,结果显示,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后,该基因显著下调表达(P<0.05);而注射白斑综合征病毒(WSSV)后,该基因显著上调表达(P<0.05)。综上所述,PtJNK基因是一种广泛表达基因,且在不同的病原感染情况下,该基因的表达模式存在差异,在免疫防御过程中具有重要作用。     

三疣梭子蟹基因组小卫星特征分析

通过构建三疣梭子蟹部分基因组文库,对获得的4 164个克隆测序,共获得总长度为622 409bp的DNA序列。在序列拼接后长度500～1500bp的709个克隆中,筛选到130个小卫星序列,其序列总长度占测序序列总长度的2.55%。小卫星序列中,以12bp重复单位的序列数量最多（10.77%）,总体趋势表现为重复单位越长,相应的重复序列数目越少（R=-0.663,p＜0.01）。小卫星重复单位拷贝数分布范围以8bp重复单位最广为3.9～66.5;其次是13bp重复范围在2.0～40.6;再次是26bp重复,范围在2.3～21.0。平均拷贝数最高的三种重复类型分别为8bp重复(19.96),25bp重复(16.00)和22bp重复(15.85)。小卫星序列中各重复单位的拷贝数分布范围2～66.5,集中分布在2～25,且表现为拷贝数目越大,其相应的重复序列数目越低的趋势。130个重复序列分别由123种重复单位所组成, 因而小卫星重复序列的类型很多。 我们初步分成三类：两种碱基组成类别、三种碱基组成类别和四种碱基组成类别, 并进一步根据各个重复序列中所含有的碱基种类的数量从大到小排列这些碱基而分成若干小类。从这些分类中可以看出,三疣梭子蟹基因组中的小卫星整体上是富含A/T的重复序列, 并揭示了其与微卫星重复序列之间的关系, 即一部分小卫星重复序列可能起源于微卫星序列。     

三疣梭子蟹精子活力评价方法的研究

采用染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法,对三疣梭子蟹精子的活力进行评价研究.结果表明,采用台盼蓝染色无法清晰辨别死、活精子.采用曙红B染色,精子分别呈现不同的染色特征:活精子无色,细胞边界清晰可辨,在光学显微镜下观察可见顶体中央突起的圆锥状结构和辐射臂;死精子细胞边界有稍许模糊,核杯和顶体均着色.最适的曙红B浓度和染色时间分别为2%和2 min.钙离子载体.A23187诱导精子顶体反应的结果显示:在诱导时间和A23187浓度分别为50 min和30μg·mL-1时,校正顶体反应率达到(92.73±2.43)%.对这两种活力检测方法的比较分析显示,曙红B染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法的活力检测值与样品理论值呈显著正相关(P<0.01),他们二者之间亦呈显著正相关(P<0.01),说明这两种方法均可用于精子活力检测,其结果具有可比性.     

壳寡糖对三疣梭子蟹免疫力的影响

为研究壳寡糖对三疣梭子蟹免疫功能的影响,设置了含壳寡糖0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/kg（分别为T0、T1、T2、T3和T4组）的5组试验饲料饲喂三疣梭子蟹,分别在第10 d、20 d和30 d取血清进行酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LSZ）和过氧化物酶（POD）活性的测定,试验结束时测定血细胞的密度。结果显示,在基础饲料中添加适量的壳寡糖可以显著性提高ACP、T-SOD、LSZ、POD活力（P〈0.05）,对PO和AKP活力促进效果不显著（P〉0.05）。壳寡糖可以显著提高三疣梭子蟹血细胞密度（P〈0.05）,对3种血细胞所占比例有一定的影响（P〉0.05）。综合考虑,T2、T3组对三疣梭子蟹免疫促进效果较好,建议基础饲料中壳寡糖添加量为1.0～1.5 g/kg。     

三疣梭子蟹卵巢发育期间Y器官组织学变化

通过活体解剖和组织切片技术,系统研究了三疣梭子蟹卵巢发育过程中Y器官的外观和组织学结构变化。结果表明,三疣梭子蟹Y器官为淡黄色、扁平球状,其中分布有血窦和血管,腺细胞细胞质染色不明显,细胞核呈卵圆形,嗜碱性较强。卵巢发育过程中,Y器官组织学具有以下特征和变化:Ⅰ期,血窦和血管清晰可见,分布于血窦附近的腺细胞膨大呈泡状,且细胞核直径显著大于内部的细胞核直径(P<0.01);Ⅱ期,血管收缩,腺细胞体积变小,胞核直径减少为(3.64±0.62)μm(P<0.01);Ⅲ期,血窦边界模糊,呈退化状态,细胞核呈强嗜碱性;Ⅳ期,Y器官小叶间的空隙变大,腺细胞边界消失,很难发现核仁;Ⅴ期,Y器官小叶间的空隙进一步变大,细胞核直径进一步缩小、核膜皱缩。以上结果表明,三疣梭子蟹卵巢发育过程中,Y器官呈退化的非分泌状态,因此,Y器官可能没有参与卵巢发育的内分泌调控。     

水体Cu2+对三疣梭子蟹主要组织ROS含量和抗氧化能力的影响

为探究水体Cu2+对三疣梭子蟹主要组织氧自由基水平和抗氧化能力的影响,采用生态学单因子梯度试验方法,研究了不同浓度水体Cu2+(0.04、0.4、2、4 mg·L-1)胁迫下三疣梭子蟹鳃、肝胰腺、肌肉组织中的活性氧(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果表明:与对照组相比,低浓度水体Cu2+(0.04、0.4 mg·L-1)对三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量没有显著影响,而高浓度水体Cu2+(2、4 mg·L-1)会导致鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量显著升高,且升高的幅度与Cu2+浓度成正比。低浓度水体Cu2+(0.04、0.4 mg·L-1)对三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织的SOD活性和T-AOC均具有诱导作用,随实验时间的延长,SOD活性和T-AOC呈峰值变化;而高浓度水体Cu2+(2、4 mg·L-1)短时间内对梭子蟹的鳃、肝胰腺、肌肉组织的SOD活性及鳃T-AOC具有诱导作用,但对肝胰腺和肌肉T-AOC却有明显的抑制作用,在实验时间内两种组织T-AOC始终低于对照组,并呈逐渐下降趋势。由此说明低于0.4 mg·L-1的水体Cu2+在三疣梭子蟹抗氧化解毒能力的可控范围,但高于2 mg·L-1的水体Cu2+会对三疣梭子蟹主要组织细胞造成损伤,使之抗氧化解毒能力下降。抗氧化酶和非酶抗氧化物在三疣梭子蟹抵御Cu2+胁迫中共同发挥作用,三种组织SOD和T-AOC表现出明显的时间和剂量效应。