松江鲈白介素15(TfIL-15)的结构特征与重组表达

为研究白介素15(Interleukin-15, IL-15)在松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)先天免疫中的功能,本研究利用RACE技术克隆得到松江鲈IL-15基因(命名为TfIL-15)的全长cDNA序列,其长度为1140 bp,包括5¢-非编码区(5¢-UTR) 165 bp、开放阅读框(ORF) 522 bp和3¢UTR 453 bp。在5¢UTR区域,存在4个读码框外的AUG翻译起始位点。基因ORF编码173个氨基酸(aa),其中,前59 aa为信号肽序列。成熟肽全长为114 aa,预测分子量为12.975 kDa,理论等电点为5.15。同源比对发现,鱼类IL-15变异程度较高,TfIL-15与其他鱼类IL-15同源性在23%~61%之间。多序列比对和三维结构构建结果显示,TfIL-15具有典型4个α螺旋二级结构,形成二硫键的4个半胱氨酸高度保守。qRT-PCR分析表明,TfIL-15广泛表达于松江鲈各组织中。腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)后,TfIL-15 mRNA在血液、皮肤、肝脏和脾脏中均上调表达。在皮肤和血液中,刺激后2 h表达量迅速上调至最高峰,分别为对照组的74倍和41倍。脾脏和肝脏在刺激后12 h分别达到对照组的3倍和18倍。肝脏中,刺激后96 h,表达量再次上调至对照组的86倍。上述结果表明,TfIL-15可能参与了松江鲈抵抗外界刺激的先天免疫过程。另外,通过构建TfIL-15成熟肽的原核表达载体,成功获得重组蛋白,为进一步研究TfIL-15蛋白的功能奠定了基础。     

真鲷虹彩病毒引起养殖斑石鲷大规模死亡的研究

2017年8月,山东省烟台市某养殖场网箱养殖的斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼突然发病并大量急性死亡。疾病调查显示,养殖海域水温为26℃~28℃;病鱼为4~5月龄,全长为(16.3± 1.6) cm,体重为(156.9±37.0) g;80万尾斑石鲷幼鱼2周内累积死亡率达90%以上,经济损失惨重。临诊检查发现,病鱼体表无明显损伤,但活力差、呼吸急促。剖检可见病鱼脾肿大、质地脆、易碎,肾糜烂,肝有出血点。组织切片观察发现,病鱼脾、肾造血组织中可见许多直径约为20 μm的肿大细胞,肿大细胞内含有大量直径约为145 nm、呈六边形的病毒颗粒。用过滤除菌的病鱼脾组织匀浆液,腹腔注射感染健康斑石鲷,感染组14 d内累积死亡率达95%。人工感染病鱼表现出与自然发病鱼类似的外观症状,且在脾、肾组织切片中也可观察到大量的肿大细胞及相似的病毒粒子。使用特异性PCR引物,从自然发病鱼和人工感染病鱼的肝、脾和肾组织中均检测到鱼类虹彩病毒的高强度感染。克隆、测序得到了1362 bp的病毒主要衣壳蛋白基因(MCP),序列比对显示,该病毒的MCP序列与真鲷虹彩病毒(RSIV) RIE12-1的相应序列完全相同。构建的虹彩病毒系统发育树也显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群,是RSIV的一个分离株。本研究首次证实RSIV可以导致斑石鲷大规模死亡,研究结果为诊断和防治斑石鲷病毒病提供了重要参考。     

松江鲈鱼ISSR-PCR反应体系的建立及优化研究

[目的]建立及优化松江鲈鱼ISSR-PCR的反应体系。[方法]采用ISSR-63引物,通过正交试验设计,分别对TaqDNA聚合酶、Mg2+d、NTPs和引物浓度等4种PCR原料进行优化,以确立松江鲈鱼的ISSR-PCR反应最佳体系,并通过温度梯度PCR,筛选适宜的退火温度。[结果]确定了松江鲈鱼的最适ISSR-PCR反应体系,20μl反应体系中含2.5 mmol/L Mg2+,250μmol/L dNTPs,0.25μmol/L引物,1.0UTaqDNA聚合酶,30 ng DNA模板及1×PCR buffer,确立退火温度为50.8℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生松江鲈鱼样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带。[结论]该研究为松江鲈鱼的遗传多样性分析及种质资源研究奠定了一定的基础。     

光唇鱼赤皮病病原研究

浙江新昌某养殖场的光唇鱼(Aerossocheilus fasciatus)爆发赤皮病,发生大量死亡,从患病鱼肝脏中分离到菌株GCL100301,通过人工感染试验,确定该菌株为病原。通过生理生化和分子生物学鉴定,该菌株GCL100301被鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。通过对该菌株的药物敏感试验,发现其对环丙沙星、新霉素敏感,对青霉素、复方新诺明、先锋V、新生霉素、痢特灵和头孢噻吩完全耐药。研究结果为光唇鱼病害防治提供了理论依据。     

暗纹东方鲀生长激素基因克隆与同源性分析

克隆获得暗纹东方鲀GH基因,该基因包含6个外显子和5个内含子,在此基础上获得其cDNA序列,共有591bp,编码196个氨基酸。将该cDNA序列转换成蛋白质序列后,结合NCBI数据库中得到的其它24种脊椎动物生长激素基因的蛋白质序列,运用MEGA3.1,以UPGMA法构建东方鲀等25种脊椎动物的生长激素基因进化树,14种鱼类中除了鳗鲡和鳝鱼外聚为一大类,其它动物中哺乳动物、反刍动物、家禽、爬行动物、人以及鳗鲡等聚为另一大类,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀生长激素基因的氨基酸同源性达到100%,与斗鱼、杜父鱼、金鲈生长激素基因的氨基酸同源性达到70%以上,与人的生长激素基因的氨基酸同源性也达到40%;斑马鱼、草鱼、鲋鱼以及鲤鱼之间生长激素基因的氨基酸同源性在85%以上;哺乳动物、反刍动物、家禽的生长激素基因的氨基酸同源性在90%左右。从进化树的结果来看,与传统分类学研究结果基本一致,为进一步研究GH基因在胚胎发育及个体生长中的功能奠定基础。     

黄山殷溪河光唇鱼食性特征的初步研究

基于2014年7月于黄山殷溪河采集的94尾光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)标本,初步研究了该物种的食性特点,分析了其食物组成及其多样性随年龄和全长增长的变化。渔获物的个体全长为17.93~357.72 mm,分为5个年龄组。光唇鱼的食物由陆生和水生植物、陆生昆虫、碎屑以及环节动物、软体动物、甲壳动物、水生昆虫等水生动物组成,其中以水生昆虫、水生植物和碎屑为常见和优势饵料种类。单因素相似性分析结果显示,1~3龄组间的食物类型数无显著差异,但食物多样性指数和宽度指数均存在显著差异。Pearson's相关分析结果显示,随个体全长增大,食物类型数显著增多而宽度指数显著下降,但食物多样性无显著变化。此外,冗余分析结果显示,光唇鱼的食物组成与个体全长显著相关;随个体全长增大,胃含物中水生昆虫类逐渐减少而甲壳类和陆生昆虫逐渐增多,但水生植物和碎屑的多度与全长无明显关系。     

斑石鲷含肉率与肌肉营养成分分析

为研究斑石鲷Oplegnathus punctatus的营养价值与鲜美程度,采用营养测试方法对体质量为(272.11±33.89)g的斑石鲷含肉率和肌肉营养成分进行了测定。结果表明:斑石鲷的含肉率为66.06%±0.93%;肌肉(鲜样)中水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分的质量分数分别为70.50%、20.20%、7.80%、1.30%;肌肉蛋白质中共检测出18种氨基酸,占干样品总量的65.17%,其中人体必需氨基酸(8种)总量为27.15%(干样,下同),占氨基酸总量的41.65%,必需氨基酸组成与FAO/WHO要求一致;斑石鲷的必需氨基酸指数为82.98,限制性氨基酸为色氨酸、胱氨酸,4种鲜味氨基酸总质量分数为38.49%;肌肉中脂肪酸含量丰富,多不饱和脂肪酸含量达28.41%,其中EPA、DHA含量分别为5.59%和13.60%,常量及微量元素含量丰富。研究表明,斑石鲷肌肉中含有丰富的EPA、DHA和矿物元素,具有较高的食用价值和保健作用。     

温度、盐度对条石鲷胚胎发育影响及初孵仔鱼饥饿耐受力

研究了盐度、温度对条石鲷胚胎发育的影响和初孵仔鱼对饥饿的耐受力。结果表明,胚胎发育的适宜盐度范围为20～35,最适盐度范围为25～30,孵化率都在89%以上,盐度低于20或高于35,孵化率都降低。盐度对孵化时间有一定影响,盐度高于35或者低于15条件下孵化时间都延长。胚胎发育的适宜温度范围为21～27℃,孵化率都在77%以上,最适温度范围为23～25℃,孵化率达89%以上,低于19℃或者高于27℃时孵化率降低且初孵仔鱼畸形率升高。胚胎孵化时间与温度成负相关关系,胚胎发育速率与温度成正相关关系。条石鲷胚胎发育的生物学零度（阈温度）为10.06℃,有效积温值为405.3℃·h。对胚胎发育的Q10值进行了计算。饥饿条件下,条石鲷初孵仔鱼8日龄全部死亡,半数死亡时间出现在第6天,饥饿对初孵仔鱼生长具有明显的抑制作用。     

Stages of rock bream oplegnathus fasciatus (Temminck et Schlegel 1844): embryonic development

The embryonic development of rock bream, Oplegnathus fasciatus, was studied from fertilization until hatching. The hatching occurred approximately at 25 h after fertilization at 23.5 ± 0.5 °C. The embryogenesis is divided into seven stages: Zygote period, Cleavage period, Morula period, Blastula period, Gastrula period, Segmentation period and Hatching period. The first cleavage furrow of rock bream fertilized eggs is vertically oriented, as is usual until horizontal cleavage occurs at the fifth cleavage. The blastocoel is observed between the blastoderm and I‐YSL at blastula period. At 90%‐epiboly stage, the earliest somitic furrow appears in the middle of embryo. The myotomes develop from somites at 15 h 30 min post fertilization. The Kupffer's vesicle consisting of ventrally I‐YSL and dorsally columnar cells appears with the completion of epiboly. It degenerates gradually with the penetration of some eosinophilic granules and disappears completely at 20 h 30 min after fertilization. The digestive tract, a straight tubule, is differentiated into foregut, midgut and hindgut. The epithelium of midgut and hindgut are the monolayer cubic and columnar cells respectively. The staging series provides a preliminary baseline reference for future studies on embryos of the rock bream.     

中国养殖斑石鲷(Oplegnathus puncatus)上皮囊肿病的发现及显微观察

2015年,山东省某养殖场工厂化养殖的斑石鲷(Oplegnathus puncatus)幼鱼(全长为15 cm左右)因病陆续死亡,15d内累积死亡率达40％以上.现场调查发现,发病池水温为21℃,盐度为30.患病鱼群散开、不聚集.病鱼身体侧偏,活力差,常贴底或者贴壁,严重者随着水流漂流.病鱼呼吸困难,口部持续张开,鳃盖开合频繁,对投喂的食物无反应.但病鱼反应灵敏,难以捕捉.临床检查和剖检可见病鱼鳃表面覆盖着大量黏液,鳃丝有损伤,肠道无食物.取病鱼鳃丝制成水浸片,在光学显微镜下观察,鳃丝上可见到许多直径约为30-70 μm的囊肿物,外观圆形或卵圆形,呈浅黄棕色.在苏木精-伊红染色的石蜡切片中,病鱼次级鳃丝末端粘连,许多上皮细胞膨大呈囊肿状.囊肿嗜碱性,内部均质化.在扫描电子显微镜下观察,病鱼鳃丝呈棍棒化,鳃小片被大量黏液覆盖,表面光滑的囊肿细胞镶嵌其间.通过上述疾病现场调查、病鱼的临床检查、鳃组织的光学显微镜和扫描电子显微镜病理观察,可以初步确定该病为斑石鲷上皮囊肿病.这是上皮囊肿病在中国养殖斑石鲷中首次被发现和记载.