虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法.结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101-8.3×108 copies/μ1的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=-3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992),扩增效率为98.1％,检测灵敏度下限为8.3× 10(1) copies/μ1,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性.对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍.利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平.本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考.     

舟山地区大棚凡纳滨对虾生长缓慢病因的调查分析

2013年以来,浙江省舟山地区大棚养殖的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)普遍出现生长缓慢、养殖成功率低的现象。为了查明该原因,本研究采用分子生物学和组织病理学等方法对引起对虾生长缓慢的病因开展了调查分析。结果显示,采集的270份病虾样本中,对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)PCR阳性检出率高达85.19%,传染性皮下及造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)检出率为0;所有采集的病虾样本中也未分离到常见的致病菌;54份正常的对虾样本中EHP和IHHNV均未检出。将病虾PCR扩增产物进行序列测定和比对分析,结果获得的序列片段与Gen Bank中已有EHP相关序列相似性高达99.55%;病虾的肝胰腺组织病理切片观察显示,在虾肝胰腺组织中可观察到处于各个生长发育阶段的EHP。通过上述研究,初步认为EHP是引起舟山地区大棚养殖对虾生长缓慢的一个重要病原。     

虾肝肠胞虫全基因组分泌蛋白的预测分析

分泌蛋白是在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质,其在许多原生动物寄生虫操纵宿主细胞和影响虫体的毒力中起着重要作用。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一种可感染多种经济虾类的专性细胞内寄生虫,是近年来影响全球对虾养殖生产较严重的病害之一。本研究利用真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred2.0对EHP全基因组的分泌蛋白进行预测,并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息进行分析,对分泌蛋白功能进行分析。结果显示,分泌蛋白氨基酸长度主要集中在30~400 aa之间;信号肽长度集中在9~32 aa之间;信号肽切割位点处以疏水性氨基酸为主。对信号肽进行基序分析,发现存在基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释,发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。研究结果有助于了解EHP对宿主的侵染机制,同时为进一步明确EHP的致病相关因子提供理论依据。     

一对虾养殖场的多病原跟踪

本研究通过对一对虾养殖场定期采样,采用分子生物学鉴定方法,分别对对虾体内及水环境中弧菌(Vibrio sp.)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及主要病毒性病原进行了跟踪检测,同时,检测了水环境中的氨氮及亚硝基氮含量的变化趋势。结果显示,该对虾养殖场中存在的主要病原为多种致病弧菌和EHP,未检测出对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)及传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV);该养殖场中弧菌检出种类达到16种,其中,主要的弧菌种类有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌 (V. alginolyticus)、欧文氏弧菌(V. owensii)、创伤弧菌(V. vulnificus)、哈维氏弧菌(V. harveyi),且存在导致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VPAHPND);养殖中期大棚养殖池水体氨氮及亚硝氮浓度分别达到(3.5±2.0)、(8.2±0.7) mg/L,显著高于室外养殖池水体氨氮及亚硝基氮浓度(P<0.05)。养殖期跟踪的7个虾池中,出现严重对虾病害的大棚养殖池比例达到100%,而室外养殖池仅出现轻度对虾病害,发病池比例为25%。根据研究结果推测,造成大棚养殖池对虾发病死亡的主要原因为养殖对虾感染弧菌及虾肝肠胞虫,同时,养殖密度大、水体氨氮及亚硝基氮浓度过高等在对虾病害发生中起到了协同作用。本研究结果可为当前对虾养殖病害防控技术提供理论支持和科学依据。     

家蚕分离的微孢子虫Vairimorphasp.MG_4的研究

从家蚕分离到一种小型微孢子虫 (MG4 )。MG4 孢子大小为 2 72± 0 1 2 μm× 1 98±0 2 2 μm ;孢子具单核、双核 2种类型 ,极丝在 6～ 9圈之间 ;在家蚕体内以 2种不同的生活史发育 ,发育过程符合变态孢虫属Vairimorpha微孢子虫发育特征 ;对家蚕有弱的食下传染能力 ,主要寄生在后部中肠的气管丛 ;感染家蚕后未见胚种传染     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及虾肝肠胞虫(EHP)的荧光定量PCR检测

2013年,河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗期出现死苗、出苗率低的情况,生产上,仔虾个体大小差异较大,造成了严重损失.本研究采用荧光定量PCR方法(Real-time PCR)对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测.结果显示,传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)均有检出.IHHNV阳性检出率100％,每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数为103-107,且个体较大的样品(1.2-2.0 cm)携带病毒拷贝数偏高;EHP阳性检出率为49.1％,每微克对虾组织DNA的拷贝数为103-105,且集中于个体较小样品(0.7-1.1 cm).对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析,显示IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关,虾组织IHHNV平均载量达8.51×104 copies/μg DNA,为较高的感染水平;EHP的载量与对虾生长速率呈负相关关系,与较大个体阳性检出率较低相对应,虾组织EHP平均载量达到2.19× 104 copies/μg DNA,为较高的感染水平.由此,该批凡纳滨对虾仔虾患病为IHHNV和EHP的混合感染所致,本研究数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据.     

Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi from large-scale cattle farms in Anhui Province, China

To investigate the prevalence of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi from large-scale cattle farms in Anhui Province, 955 fecal samples were collected from 16 cattle farms from March to October 2018, which included six dairy farms (526), seven yellow cattle farms (323), and three water buffalo farms (106) in different regions of Anhui Province. PCR was conducted on all fecal samples using the 18S ribosomal RNA of Cryptosporidium spp. and internal transcribed spacer gene of E. bieneusi to detect these two pathogens, and the positive samples were sequenced and analyzed. The results showed that 23 (2.4%) and 40 (4.2%) out of the 955 samples were positive for Cryptosporidium spp. and E. bieneusi, respectively. There were 11 (2.1%), 10 (3.1%), and 2 (1.9%) positive samples of Cryptosporidium spp. and 16 (3.0%), 23 (7.1%), and 1 (0.9%) positive samples of E. bieneusi collected from dairy cattle, yellow cattle, and water buffalo, respectively, and no co-infection was identified in this study. All positive samples of Cryptosporidium spp. were C. andersoni with some variations. Ten E. bieneusi genotypes were obtained, including two known genotypes, J and CHN11, and eight new genotypes, named AHDC1 and AHYC1-7. The genotype CHN11 belonged to zoonotic Group 1, and the other nine genotypes belonged to Group 2, which is mainly documented in ruminants. These results indicated that Cryptosporidium spp. and E. bieneusi infections were present in large-scale cattle farms in Anhui Province. Therefore, attention should be paid to the development of containment strategies of these two pathogens in cattle.     

Phyllotreta nigripens (Coleoptera: Chrysomelidae), a new host of Nosema phyllotretae (Microsporida) in Turkey

In the present study we describe a Nosema infection in a Phyllotreta nigripens population. The parasite was identified as Nosema phyllotretae. The spores are oval, 3.97±0.47 μm (2.85–4.75) in length and 2.19±0.36 μm (1.90–2.85) in width. The polar filament has commonly 14 coils. The spore wall is 138–200 nm thick and made up of a clear endospore (88–140 nm) and a uniform exospore (40–70 nm). The polar filament measures 100–125 nm in diameter in the mature spirals. The polaroplast is thin lamellar. This study presents P. nigripens as a new host for N. phyllotretae and a second infection locality in Turkey.     

山东省病原性家蚕微孢子虫的初步研究

从山东省境内家蚕成虫体内分离到 4种病原性家蚕微孢子虫 ,与N .b比较研究结果表明 ,4种微孢子虫的大小、形态、极丝圈数及倾斜角与N .b相比均存在差异 ,但血清学反应及在蚕体内的发育过程与N .b相同。初步认为该 4种病原性微孢子虫为N .b的同属微孢子虫。这 4种微孢子虫对家蚕具有极强的食下感染率和胚种传染力。