EHP、SHIV双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建及应用

本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针。建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。结果表明：该方法检测限可达10 copies/μL,其敏感性是SYBR Green real-time PCR的10倍,普通PCR法的100倍;对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌,以及桃拉综合征病毒的检测结果均为阴性,表明无交叉反应,具有良好特异性;重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数小于4%,具有良好的稳定性。对37份已知检测结果的样品进行检测,结果符合率为100%。本研究建立的EHP和SHIV检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对虾隐性感染的早期监测。     

2种野外昆虫来源微孢子虫的超微结构及生活史观察

将从湖南蚕区野外昆虫菜粉蝶(Pieris rapae)、桑尺蠖(Phthonandria atrilineata)分离到的2种微孢子虫感染家蚕,观察微孢子虫的寄生组织、生活史以及原代微孢子虫与在蚕体侵染繁殖的第1代微孢子虫的超微结构,作为探讨家蚕微粒子病发生与野外昆虫微孢子虫的关系的病原生物学依据之一。用Giemsa染色镜检观察的结果显示,2种来源的微孢子虫可在家蚕幼虫体内全面寄生,在中肠、丝腺、马氏管、脂肪体、生殖腺、肌肉组织、气管丛等组织中均能检出。电子显微镜观察2种来源的微孢子虫的超微结构,并与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)比较,结果显示在家蚕体内继代的源自菜粉蝶和桑尺蠖的微孢子虫的超微结构特征与Nb基本一致,孢子壁由3层组成,极体分为前后2部分,极丝同型,核成对出现,核形不规则,核膜双层,粗面内质网附含大量的核糖体,孢子后部有后极泡。2种来源的微孢子虫在家蚕体内的发育过程较为相似,所有时期的核都成对出现,以二分裂方式增殖,发育周期分别为72、96 h。     

云南省怒江州部分地区独龙牛毕氏肠微孢子虫感染情况及基因分型研究

为了解云南省怒江州独龙牛毕氏肠微孢子虫感染情况,从怒江州的鸠门当、古泉村、亚左洛村、茨开镇、独龙江乡分四个季度(春、夏、秋、冬)采集独龙牛粪便样本1129份,采用分子生物学技术对其毕氏肠微孢子虫感染情况进行调查研究。结果发现,所调查地区独龙牛毕氏肠微孢子虫总感染率为1.68%(19/1129);各地点之间感染率差异显著(P<0.05),以独龙江乡感染率最高;4个季度中夏季感染率最高3.26%(9/276),春、秋和冬感染率分别为1.10%(3/272)、1.28%(4/312)和1.12%(3/269),但差异不显著(P>0.05)。序列分析发现,在19个阳性样本中成功鉴定出4种已知基因型(EbpC、BEB4、CHN3和CHN4)及2种新基因型(YNNJ1和YNNJ2),丰富了毕氏肠微孢子虫基因型数据。系统发育分析表明,所得6种基因型均为人兽共患基因型,提示怒江州独龙牛毕氏肠微孢子虫存在人兽互传的潜在风险。     

微孢子虫的发芽及对细胞的感染性

M32 (Thelohantia)、Nosemabombycis、M12 (Vairimorpha)和来自大菜粉蝶 (PierisbrassicaeLinnaeus)的微孢子 (PBL)经KOH或EDTA法诱导后 ,调查其在PBS、TEK或Grace培养液中的发芽率和对Bm、Antheraeaeucalypti细胞的侵染性。结果表明 ,同一种发芽方法 ,4种微孢子的发芽率存在明显差异 ;发芽培养液不仅影响发芽率 ,而且也影响微孢子原虫对细胞的感染性。     

南美白对虾肝肠胞虫的分离及形态学观察

为了研究江苏地区感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的形态学特点,分析与国外报道的差异性,本研究以江苏地区感染肝肠胞虫的南美白对虾肝胰腺组织为研究材料,通过蔗糖密度梯度离心等方法进行肝肠胞虫初步分离纯化,构建一种肝肠胞虫荧光染色检测方法,显微观察肝肠胞虫的孢子形态结构。结果发现感染江苏地区南美白对虾的肝肠胞虫孢子主要分布在35%~40%浓度的蔗糖层面,可推算其密度为1.15~1.17 g/m L。荧光显微镜下可见孢子椭圆或圆形,呈亮蓝色,孢子微小但可计数,显微观察可见肝肠胞虫孢子大小约为1.7μm×0.9μm,外壁上有大量白色瘤状物,疑似胞壁蛋白,孢子表面布满细小褶皱,孢子具有一个细胞核,极丝4~6圈,细胞壁由一相对薄的电子透亮的孢子内壁和电子致密的孢子外壁组成。结论认为江苏地区南美白对虾肝肠胞虫的形态结构与国外报道的吻合,本研究建立的肝肠胞虫分离纯化、荧光染色方法以及取得的肝肠胞虫形态学资料可为其检测和研究提供参考。     

虾肝肠胞虫(EHP)孢子的纯化和计数

采用差速离心和密度梯度离心,从感染虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)对虾的肝胰腺中,尝试纯化出孢子,并应用透射电镜、荧光桃红染色和血球计数板计数的方法对纯化出的孢子进行了观察和计数。结果表明,从1g的EHP载量为(4.7±2.2)×104 copies/ng DNA的肝胰腺组织中经差速离心和密度梯度离心方法分离到EHP的孢子,电镜观察孢子为大小在0.7～1.2μm的椭圆形,纯化孢子悬液用血球计数板计数显示孢子浓度为5.30×103个/μL,蔗糖密度梯度中的纯化孢子区带含有的孢子总数约1.06×106个。     

动物园圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫分子流行病学调查

为了解各地动物园圈养大熊猫的毕氏肠微孢子虫感染情况及其人畜共患风险,采用基于ITS基因的巢氏PCR方法,对江苏、福建、浙江等10个省(市、自治区)的动物园圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫的感染情况及基因分型进行调查和检测。在31份大熊猫粪便样品中,共检测到毕氏肠微孢子虫阳性14份,总感染率45.2%,检测出SC02(13/14)和Peru6(1/14)两种毕氏肠微孢子虫基因型。种系发育分析表明,SC02和Peru6都属于具有人畜共患潜能的group 1b。本实验首次发现SC02基因型毕氏肠微孢子虫感染大熊猫,表明大熊猫可能作为毕氏肠微孢子虫的储存宿主引起人微孢子虫病,拓宽了基因型SC02的毕氏肠微孢子虫宿主范围。     

家蚕微孢子虫单抗金银染色法检测技术的研究

使用新构建的抗家蚕微孢子虫（N．b）的单克隆抗体,结合免疫金银染色（IGSS）,进行检测N．b。设计6种温度和5种时问,对N．b等9种微孢子虫检测,结果表明,该细胞株单抗直接IGSS法最佳工作条件：胶体金标记pH值6.2～6.5,金标抗体染色37℃、保湿30min,经显影后光镜观察,N．b孢子周边被染上棕褐色,其它类型孢子呈无色或浅褐色;实验还比较了抗原涂片后,不同物理、化学方法固定,结果甲醇固定效果较好。     

舟山地区大棚凡纳滨对虾生长缓慢病因的调查分析

2013年以来,浙江省舟山地区大棚养殖的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)普遍出现生长缓慢、养殖成功率低的现象。为了查明该原因,本研究采用分子生物学和组织病理学等方法对引起对虾生长缓慢的病因开展了调查分析。结果显示,采集的270份病虾样本中,对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)PCR阳性检出率高达85.19%,传染性皮下及造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)检出率为0;所有采集的病虾样本中也未分离到常见的致病菌;54份正常的对虾样本中EHP和IHHNV均未检出。将病虾PCR扩增产物进行序列测定和比对分析,结果获得的序列片段与Gen Bank中已有EHP相关序列相似性高达99.55%;病虾的肝胰腺组织病理切片观察显示,在虾肝胰腺组织中可观察到处于各个生长发育阶段的EHP。通过上述研究,初步认为EHP是引起舟山地区大棚养殖对虾生长缓慢的一个重要病原。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法.结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101-8.3×108 copies/μ1的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=-3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992),扩增效率为98.1％,检测灵敏度下限为8.3× 10(1) copies/μ1,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性.对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍.利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平.本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考.