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为了阐明草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的感染机制,深入探究VP56 (Ⅱ型和Ⅲ型GCRV特有的纤维蛋白)与宿主细胞蛋白的相互作用。实验通过免疫共沉淀(co-IP)发现,VP56与细胞内定位于内质网的分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)发生相互作用。而后,VP56与GRP78的互作通过基于远红外红色荧光蛋白mNeptune的双分子荧光互补系统(BiFC)得到验证。在VP56稳定表达的草鱼肾细胞系(CIK)中,相较于CIK细胞,内质网则形态发生巨大变化,产生肿胀、扩张、脱粒等现象,说明VP56激活内质网应激。通过对内质网应激下游转录因子的mRNA水平检测,发现VP56激活活化转录因子6 (ATF6)介导的信号转导途径,激活非折叠蛋白反应。研究表明,GCRV-Ⅱ感染过程中破坏了细胞稳态、激活内质网应激。本研究为GCRV感染机制和抗GCRV病毒研究提供了新思路,揭示了一种新的病毒逃逸机制,有助于淡水养殖产业中草鱼出血病的防控。 相似文献
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为研究II型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)病毒样颗粒(viruses-like particles, VLPs)疫苗,本试验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(baculovirus expression vector system, BEVS)将编码VP35蛋白的GCRV-S11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTATM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示,本试验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染sf9细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)进行检测。结果显示,GCRV的3个蛋白在sf9昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径大小为65-72nm。本试验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。 相似文献
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为了探究自然发病和人工注射感染草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(GCRV-Ⅱ型)草鱼的临床症状、病理特征和病毒分布的区别,实验采用临床剖检、组织病理学观察、分子生物学检测、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)等检测方法开展实验,通过对自然发病和人工注射感染草鱼的临床症状进行比较,结果显示,患病草鱼的眼眶、鳃盖、口腔、腹部、鳍条基部、肠道、肌肉出现明显的点状出血,且后者的出血情况比前者更为严重;比较组织病理切片,发现草鱼感染组织出现不同程度的充血和红细胞充盈现象,其中,人工注射感染草鱼的肠道、肌肉和肝胰脏的病变程度更为严重,呈现出较为严重的组织内出血和病变,而自然发病草鱼的鳃和脾脏的病变程度更为严重,鳃呈现出较为严重的充血和炎症增生物,脾脏出现大面积含铁血黄素沉积块病灶。qRT-PCR和Western blot检测结果显示,GCRV在不同的组织中均有分布,头肾在两种感染方式的患病草鱼中的病毒量都比较高,人工注射感染草鱼的肝胰脏、肠道和肌肉的病毒量较高,自然发病草鱼的中肾、鳃和脾脏的病毒量较高。因此,在人工注射感染时,肝胰脏、肠道和肌肉可能是GCRV入侵的主要靶... 相似文献