支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立

以小鼠胎儿和牛睾丸为材料 ,以含 1 5 % NBS、0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇、0 .1 μmol/ L Na2 Se O3的DMEM溶液为培养液 ,分离获得了传 1 5代的小鼠胎儿成纤维细胞和 5代牛睾丸成纤维细胞 ,建立了小鼠和牛类 ES细胞培养体系。结果表明 :牛睾丸成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞均属附着生长型细胞 ,与小鼠胎儿成纤维细胞相比较 ,牛成纤维细胞直径和长度大 ,生长速度快 ,易于老化 ;1 2～ 1 6日龄的小鼠胎儿最适宜分离与克隆小鼠胎儿成纤维细胞 ;在 2 5℃条件下 ,以 0 .2 5 %胰蛋白酶 0 .0 4% EDTA消化液作用胎儿小块组织分离原代小鼠胎儿成纤维细胞 ,消化液作用时间不应超过 2 0 min,以相同的消化液在 3 7℃条件下 ,离散贴壁成纤维细胞 ,作用时间以 2～ 3 min为宜 ;培养细胞密度与传代时间间隔有密切关系 ,若传代时间间隔为 3～ 4d,培养细胞浓度应为 3× 1 0 5个 / ml～ 5× 1 0 5个 / ml;在成纤维细胞分离与克隆过程中 ,培养基中添加0 .1μmol/ L Na2 Se O3 0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 1 5 % NBS,有利于 MEF和 NBTF的增殖     

改良大豆胚尖再生体系的研究

为了研究利用Thidiazuron(TDZ)建立大豆胚尖高效再生体系的可行性。跃进10号的成熟种子浸泡16 h后,收集胚尖转入添加了不同浓度的TDZ芽诱导培养基中,4周后计算出芽率,并对拔高培养基和生根培养基进行优化。TDZ浓度为0.08 mg/L时,出芽率最高,达92.6%,平均每个外植体产生的丛生芽的数目也最多。适宜大豆胚尖的芽诱导分化培养基为MS+0.08 mg/L TDZ,拔高培养基为MS+2.0 mg/L KT+0.2 mg/L NNN,生根培养基为1/2MS+1.0 mg/L IBA。利用TDZ建立大豆胚尖高效再生体系是可行的,提高了丛生芽的分化率,为快繁和提高遗传转化效率奠定了坚实的基础。     

基因组印记重组与胚胎发育

介绍了基因组印记重组对动物胚胎发育的影响。     

棉花耐盐胚性细胞系筛选及其植株再生

 继代1年以上的棉花品种珂字201下胚轴产生的胚性愈伤组织，转入加有不同浓度[0、8.56×10#+(-2)、1.71×10#+(-1)、2.57×10#+(-1)、3.42×10#+(-1)、5.13×10#+（-1）、6.84×10#+（-1）mol/L]NaCl的筛选培养基上培养，经过3代筛选，获得耐盐胚性细胞系和再生植株。NaCl显著抑制了愈伤组织的存活和生长，NaCl半致死浓度在8.56×10#+（-2）～1.71×10#+（-1）mol/L之间，致死浓度为6.84×10#+（-1）mol/L。NaCl浓度影响着体细胞胚的发生和发育，影响着体细胞胚的萌发和植株再生。添加1.71×10#+（-1）mol/L NaCl培养基，筛选出的愈伤组织生长较好，并能分化出体细胞胚和正常再生植株。在本实验中，笔者获得了耐3.42×10#+（-1）mol/L NaCl的体细胞胚和耐1.71×10#+（-1）mol/L NaCl的正常再生植株。     

皖南烟区可持续发展研究

结合皖南烟区烟叶生产的实际情况,从多个方面分析了烟区可持续发展过程中存在的制约因素,并从烟叶生产人力资源、生产种植规模化、科技支撑和服务、烟叶标准化生产管理和烟叶生产保障体系等几个方面,提出了皖南烟区生产可持续发展的若干对策及建议,为皖南烟区实现可持续发展提供参考。     

花生胚小叶体细胞植株再生系统的建立

[目的]研究花生胚小叶体细胞植株再生体系,为利用胚小叶进行外源基因遗传转化提供试验依据。[方法]以花生品种四粒红和改良海花的胚小叶为外植体,2种外植体取材方式(预培养和直接取材)为培养背景,探讨了不同取材方式下各个培养要素(基因型、培养基等)与脱分化、再分化的关系,初步建立了花生胚小叶体细胞植株再生体系。[结果]在预培养取材条件下,预培养6d的四粒红外植体在2号培养基(MS+3mg/L6-BA+1mg/LNAA)上分化得最好,每愈伤组织再生芽2.34个,预培养5d的改良海花外植体在1号培养基(MS+5mg/L6-BA+3mg/LNAA)上分化最佳,每愈伤组织再生芽2.08个。直接取材条件下,改良海花在1号培养基上每愈伤组织出芽数为6个,而四粒红为3个。直接取材在诱导愈伤组织及器官分化方面都好于预培养取材。[结论]直接取材条件下,不同培养基对诱导愈伤组织及芽分化的作用差异较大,而基因型在诱导愈伤组织上的作用有显著差异,在出芽率上的作用差异并不显著。     

Metanephric cell microenvironment induces embryonic stem cells to differentiate toward renal cells

AIM: To explore the effects of metanephric cell microenvironment on inducing embryonic stem cells (ESCs) to differentiate toward renal cells.METHODS: Embryoid bodies (EBs) of D3 mouse embryonic stem cells were prepared by hanging drop culture, and the EBs were co-cultured indirectly with metanephric cells derived from E12.5 d mouse embryo. The EBs cell with spontaneous differentiation was used as the control. The proteins of Pax2 and WT-1 were analyzed by immunofluorescence assay. The mRNA expression of Pax2, WT-1, Lim1, Sall1, Emx2, GDNF, Wnt4, BMP7, Nephl, Nephrin, KSP and CD24 genes was detected by RT- PCR.RESULTS: The genes related to kidney development were expressed in the EBs cells after co-culture on day 3, and the mRNA expression of Pax2, WT-1, Emx2, GDNF, Nephl, Nephrin, KSP and CD24 was stronger than those in control group. Pax2 positive cells were found on day 3 in the co-cultured EBs cells, and the positive cells increased on day 5 and day 7. WT-1 protein positive cells were found in the co-cultured EBs cells on day 5. No Pax2 or WT-1 positive cell was observed in control group.CONCLUSION: Metanephric cell microenvironment promotes ESCs differentiation toward renal cells.     

长寿花胚性愈伤组织的诱导及胚状体再生

 研究了长寿花胚性愈伤组织的筛选，胚状体的诱导发生、发育过程及植株再生。经过对外观及细胞学观察，看出外观质地疏松、颗粒状的淡黄色愈伤组织细胞圆形且形状规则，是胚性愈伤组织。诱导胚性愈伤组织的最适培养基为：MS+2，4-D 2 mg·L^-1 +BA 0.2 mg·L^-1；胚状体的诱导培养基为MS+BA 2 mg·L^-1 +NAA 0.2 mg·L^-1 +活性炭4 g·L^-1+蔗糖30 g·L^-1，胚状体诱导率可达185个胚状体；胚状体的再生培养基为MS+蔗糖30 g·L^-1。利用石蜡切片对胚状体的发生过程进行了观察。     

中华鳖GHITM cDNA基因克隆及表达分析

为研究GHITM基因在中华鳖(Trionyx sinensis)胚胎发育及生长中的作用,本研究通过RT-PCR和RACE方法获得了中华鳖GHITM全长cDNA序列;采用实时荧光定量PCR对GHITM mRNA组织表达及不同温度孵化胚胎发育过程中的表达特性进行分析。结果显示,中华鳖GHITM cDNA序列长度为2650 bp,开放阅读框为1050 bp,5?非编码区为123 bp,3?非编码区为1477 bp,编码349个氨基酸,编码蛋白的等电点为10.01,分子量为37.12 kDa。GHITM编码氨基酸序列由胞外区、跨膜区和胞内区组成,7个跨膜域组成跨膜区。GHITM编码氨基酸序列的同源性分析显示,中华鳖与锦龟(Chrysemys picta bellii)和绿海龟(Chelonia mydas)同属一个分支,3种鳄鱼构成一个分支,7种鸟类形成一个分支。实时荧光定量检测显示,GHITM基因在肝脏、肌肉和脑垂体中的表达水平较高,显著高于心脏、性腺、肠、肾脏和脾脏组织(P<0.05);50 g左右和500 g左右雄性个体肝脏中的GHITM基因表达量显著高于雌性个体(P<0.05);低温胁迫孵化能显著抑制胚胎肝脏中GHITM基因的表达(P<0.05)。上述研究结果表明,GHITM基因与中华鳖生长和胚胎发育密切相关,其在中华鳖胚胎中的表达受孵化温度调节。本研究为探讨中华鳖胚胎发育和生长提供理论依据。     

温度对云纹石斑鱼(Epinephelus moara)胚胎发育和仔鱼活力的影响

研究了不同孵化温度(16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃和30℃)对云纹石斑鱼(Epinephelus moara)胚胎发育的影响,记录并分析不同温度处理组受精12h后的胚胎发育时期、受精卵的孵化周期、孵化率和初孵仔鱼的畸形率,并对初孵仔鱼进行不同温度下的饥饿耐受性实验,测定其每天的存活率和生存活力指数(Survival activity index,SAI).结果显示,当温度在18-28℃范围内时,胚胎均可孵化出仔鱼,且孵化时间随温度的升高而缩短,孵化时间y与温度x呈极显著的负相关关系,y=12139x-1869,R2=0.993(P＜0.01).22℃时受精卵孵化率最高,为71.01％,该温度下对应最低畸形率(9.70％),其次为24℃时,受精卵孵化率为65.37％,畸形率为13.07％;温度低于22℃时,孵化率逐渐降低,18℃时的孵化率为24.39％;温度高于22℃时,孵化率亦明显降低,28℃孵化率最低,为16.11％,而畸形率的变化趋势与孵化率相反.温度为16℃时,受精卵发育至高囊胚期后不再继续发育;温度为30℃时,胚胎停止于胚体形成期.仔鱼的SAI值随着温度的升高先升高后降低,在20℃时,SAI值最高(25.97),仔鱼的半数死亡时间最长为7 d;22℃时,SAI值有所降低(22.38),仔鱼在该温度下半数死亡时间为6d.分析结果可知,云纹石斑鱼受精卵培育的最适温度为22-24℃,仔鱼孵化的最适温度为20-22℃.