昆明犬IGF2基因克隆、生物信息学分析及其时空表达研究

【目的】 克隆昆明犬胰岛素样生长因子2（IGF2）基因并研究其序列特征及时空表达规律,为工作犬体型及生长发育相关研究提供基础资料。【方法】 采用PCR法扩增昆明犬IGF2基因CDS区,运用生物信息学分析预测昆明犬IGF2蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR技术检测IGF2基因在2.5月龄昆明犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大腿内侧肌肉和不同年龄段肝脏中的表达情况。【结果】 昆明犬IGF2基因CDS区全长717 bp,编码238个氨基酸;系统进化树分析显示,昆明犬IGF2基因与赤狐的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析表明,IGF2蛋白分子质量为26.46 ku,理论等电点为9.61,无信号肽和跨膜结构,属于亲水性非分泌蛋白;主要分布于细胞核（47.8%）和线粒体（17.4%）,存在23个磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构与二级结构预测结果相符。组织表达谱分析显示,IGF2基因在2.5月龄昆明犬肝脏中相对表达量最高,且极显著高于肾脏、肺脏及肌肉组织（P<0.01）;仔犬期（2.5月龄）肝脏中的IGF2基因的表达量极显著高于幼犬期（6月龄）、青年期（1岁）及成年期（1.7和2.5岁）（P<0.01）。【结论】 本研究成功克隆昆明犬IGF2基因,并发现IGF2在多个组织广泛表达,在肝脏中的表达量最高,可为深入探讨昆明犬IGF2基因在生长发育中的调控机理提供参考。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

circRNA-Zfp609对C2C12成肌细胞增殖和分化的影响

【目的】试验旨在探究circRNA-Zfp609调节C2C12成肌细胞增殖和分化的潜在分子机制。【方法】利用RT-PCR和测序分析小鼠骨骼肌组织和C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、骨骼肌组织及增殖12、24、36、48 h和分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的相对表达量;实时荧光定量PCR检测分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中肌细胞生成素（MyoG）和肌球蛋白重链（MyHC）的相对表达量。用circRNA-Zfp609的干扰表达载体（siRNA）干扰细胞,通过CCK-8测定siRNA对C2C12成肌细胞增殖率的影响;用实时荧光定量PCR检测siRNA干扰对circRNA-Zfp609、MyoG和MyHC相对表达量的影响。通过TargetScan 7.0和miRDB软件预测circRNA-Zfp609上与肌肉分化相关的miRNA位点,将筛选的miRNAs的过表达载体转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609与miRNA的互作关系。根据miRNAs对circRNA-Zfp609的互作,构建circRNA-Zfp609的野生型和突变型载体并转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609对miRNA的靶向关系。【结果】PCR和测序结果表明,小鼠骨骼肌中可表达circRNA-Zfp609;circRNA-Zfp609在小鼠骨骼肌中表达水平最高,在其他组织中的表达量由高到低依次是肾脏、肺脏、心脏、肝脏、胃、脾脏和小肠。与12 h相比,在C2C12成肌细胞增殖的36和48 h circRNA-Zfp609的相对表达量显著增加（P<0.05）;与分化第0天相比,在C2C12成肌细胞分化的第1、3和5天circRNA-Zfp609的相对表达量均显著增加（P<0.05）,MyoG、MyHC的相对表达量均极显著增加（P<0.01）。与NC组相比,siRNA组C2C12成肌细胞的增殖率和circRNA-Zfp609相对表达量均极显著降低（P<0.01）,MyoG和MyHC的相对表达量显著降低（P<0.05）。circRNA-Zfp609上有miR-150-5p、miR-327、miR-344g-3p和miR-615-5p 4种与肌肉分化相关的miRNAs。circRNA-Zfp609与miR-615-5p的吸附能力最强,具有靶向结合作用。circRNA-Zfp609可以作为分子海绵与调控肌肉分化相关的miR-615-5p相互作用。【结论】circRNA-Zfp609在小鼠的组织中广泛表达,在骨骼肌中表达水平最高;circRNA-Zfp609在C2C12成肌细胞增殖和分化的不同时期差异表达,circRNA-Zfp609上有4个与肌肉分化相关的miRNAs,其中miR-615-5p与circRNA-Zfp609具有靶向关系。本研究结果可为与家畜骨骼肌生长发育相关的研究提供参考。     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的 应用生物学软件与单克隆抗体技术相结合的方法鉴定PEDV S2基因B细胞表位肽。方法 利用CLC Sequence viewer 6.8软件及在线数据库IEDB筛选出PEDV S2基因B细胞表位,并人工合成表位肽。将表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联后作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,通过ELISA法筛选出抗体效价较高的小鼠进行1次加强免疫,3 d后取脾脏制备脾细胞悬液进行细胞融合。经HAT选择培养基培养筛选有效杂交瘤细胞,采用ELISA法筛选阳性克隆继续进行扩大培养。将部分阳性杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,并收集腹水。通过ELISA方法分别检测小鼠腹水和单克隆细胞株培养上清液抗体效价,确定最高效价作为后备细胞株。结果 筛选出B细胞表位肽序列为:MQYVYTPTYYML;免疫多肽抗原后融合前血清抗体效价达到1:2 000;BALB/c小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液ELISA检测结果显示抗体效价达到1:4 000。结论 筛选出了PEDV S2基因B细胞表位,为PEDV表位肽疫苗载体构建研究提供参考。     

7种乔木对SO_2清除能力的定量评价

本文采用基于ArcView软件的CITYgreen模型,以东北林业大学哈尔滨实验林场为例,结合航片判读与实地调查,对哈尔滨市7种主要乔木树种对SO2的清除能力进行了定量评价。结果表明：糖械对SO2的清除能力最强。其次是白桦。最弱的落叶阔叶树种为水曲柳。针叶树种对SO2的清除能力普遍低于阔叶树种。随着树木的生长其清除能力有逐步增强的趋势,其清除量增加的强度在生长旺期最大,以后其强度逐渐渐弱。     

林业经济信息集成平台的构建

本文通过介绍基于J2EE技术框架的林业经济信息系统的构建,指出了为林业经济信息的集成与共享提供一个基础平台的重要作用与意义,以及其构建的方法与步骤。     

1,1—二甲基—7—异丙基—1,2,3,4—四氢萘—6—磺酸钠的合成

文章探讨了１，１－二甲基－７－异丙基－１，２，３，４－四氢萘－６－磺酸钠合成的磺化工艺。通过实验室的试验，确定了适宜的工艺条件，１，１－二甲基－７－惜内基－１，２，３，４，－四四氢萘与浓度硫酸的配比为１：１０．５（ｍｏｌ比），反应温度９０±２℃，反应时间２０ｍｉｎ，产品得率达８０．３％。同时测定了产物表面活性性能，可用作表面活性剂。     

长期低浓度SO2对油桐保护系统功能的影响

对长期低浓度SO2处理后油桐叶片中保护系统的功能进行了测定.结果表明,SO2熏气超过100 d后,油桐体内的乙醇酸氧化酶的活性水平明显提高;叶片中的自由基含量增加;过氧化物酶和多酚氧化酶的活性明显增强;同时过氧化物同工酶的谱带增加了4条;SOD的活性明显增强.这些变化表明,长期低浓度SO2处理后引起了油桐体内保护系统增强,但是不足以完全消除SO2对油桐的伤害,表现为油桐生长缓慢.     

浙江省42种园林绿化植物对SO2气体的抗性及吸收能力研究

采用人工熏气法对浙江省42种园林绿化植物对SO2气体的抗性及吸收能力进行了研究。通过系统聚类分析方法,将参试植物的抗性及吸收能力划分为弱、较弱、中等、较强和强5个等级。结果显示,42种植物对SO2的抗性和吸收能力均有较大差异,抗性最强的是常春藤,其熏气持续时间是抗性最弱植物天师栗的9.5倍;绝对吸收能力最强的和最弱的分别为杨梅4 805.54 mg·kg-1和华棕14.03 mg·kg-1。     

Genetic diversity of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) populations in northeastern and northwestern China as revealed by ISSR markers

As a N₂-fixing tree species, sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) is well adapted to arid regions and is utilized for multiple purposes in China. Current knowledge of genetic variability of H. rhamnoides is limited in terms of rangewide distributions. Eleven natural populations of sea buckthorn in northeastern and northwestern China were analyzed to detect genetic variation among and within populations, by use of ISSR (inter-simple sequence repeats) markers. Using eight primers, 207 polymorphic loci were observed, ranging in size from 250 to 2500 bp. The coefficient of gene differentiation (Gst = 0.0679) showed that the total molecular variance of 11 populations was mainly existed within populations. The genetic variation within and among the 11 populations was 93.21 and 6.79%, respectively. No significant correlation between genetic and geographic distances of the populations was found using ISSR markers. Our study provides a population-level genetic profile for further investigation and conservation of genetic diversity of sea buckthorn.