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以杏鲍菇为原料制备多肽,杏鲍菇蛋白质的提取采用碱提酸沉法,通过四因素三水平正交试验,筛选蛋白质的最佳提取条件;多肽的制备采用酶解法,以料液比,酶用量,水解时间为因素,采用三因素三水平正交试验,根据水解度确定最佳水解条件。结果表明:(1)杏鲍菇蛋白质等电点为3.6。(2)杏鲍菇蛋白质最佳提取条件为:提取温度50℃,pH 12,料液比1∶55,提取时间2.5h,提取率达46.21%。(3)碱性蛋白酶酶解制备多肽的最佳酶解条件为:料水比1∶25、温度45℃、pH 10.5、时间12h、用酶量1.0%,水解度达81.19%。 相似文献
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为了制备富含游离态异黄酮的豆豉,以前期筛选出的一株高产β-葡萄糖苷酶的菌株为菌种进行制曲。在研究接种量、发酵温度、发酵时间三种单因素对豆曲中蛋白酶和β-葡萄糖苷酶的活力影响基础上,采用三元二次正交旋转组合实验设计对制曲工艺进行优化,确定了最佳的制曲工艺条件为接种量(105.4个孢子·g-1大豆)、制曲温度26.5℃、制曲时间4 d,在此条件下,β-葡萄糖苷酶酶活力为245.24 U·g-1,蛋白酶酶活力为623.17 U·g-1。 相似文献
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目的 观察抗纤灵Ⅰ方对小鼠血吸虫病肝纤维化的干预效果,探讨抗纤灵Ⅰ方干预血吸虫肝纤维化的可能分子机制,为抗纤灵Ⅰ方的临床应用提供实验依据。方法 采用日本血吸虫尾蚴经皮肤贴片感染昆明小鼠,建立血吸虫病早期肝纤维化动物模型,将建模成功的小鼠用吡喹酮药物连续杀虫治疗后分为抗纤灵Ⅰ方低、中、高剂量组,抗纤灵Ⅰ方的丹参加味方低、中、高剂量组,秋水仙素治疗对照组,蒸馏水灌胃对照组和未做任何处理的模型对照9组。以未感染血吸虫的正常小鼠为肝纤维化阴性对照组。各实验组连续灌胃治疗8周,收集各组小鼠肝脏,HE染色观察肝纤维化病理改变,测量肝组织虫卵肉芽肿平均面积;免疫组化染色方法检测肝组织内胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、MMP-1蛋白酶以及TIMP-1蛋白的表达,比较各组间的蛋白表达差异。结果 HE染色显示,与模型组和正常对照组相比抗纤灵Ⅰ方及其丹参加味方高剂量组可显著减少肝组织虫卵肉芽肿面积(P<0.05);免疫组化染色结果显示,与模型组比较,抗纤灵Ⅰ方及其丹参加味方中、高剂量组干预后小鼠肝组织内的胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白以及TIMP-1蛋白表达显著减少(P<0.05)、MMP-1蛋白酶表达显著增加(P<0.05),但抗纤灵Ⅰ方与丹参加味方之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 抗纤灵Ⅰ方及其丹参加味方对小鼠血吸虫病肝纤维化具有较好的干预效果,但两者在疗效上差异无统计学意义,丹参未能增强抗纤灵Ⅰ方的干预肝纤维化效果;抗纤灵Ⅰ方的干预机制可能是通过抑制肝组织内胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表达,增加MMP-1蛋白酶的表达来发挥作用。 相似文献
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【目的】克隆家蚕(Bombyx mori)蛋白酶O基因Cathepsin O(BmCatO),分析其mRNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长cDNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E. coil表达菌株Rosetta(DE3),经IPTG诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白,然后利用Ni+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化,最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上,scaffold为nscaf2943,基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式,剪切体1开放阅读框(ORF)全长为1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量36 kD,等电点8.594;剪切体2 ORF全长为942 bp,编码313个氨基酸,预测蛋白分子量40 kD,等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成,剪切体2的第六外显子出现部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似,均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表明,无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类,且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟(Chilo suppressalis)组织蛋白酶O最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞,剪切体1的表达水平明显高于剪切体2,但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶O原核表达系统,利用亲和层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶O重组蛋白,并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA显示其效价高达到1﹕1 280 000。Western印迹结果表明,该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶O重组蛋白。【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。 相似文献
117.
【目的】探讨甲醇和十二烷基磺酸钠(SDS)对日本鳗鲡(Anguilla japonica)肠道蛋白酶催化活力的影响,揭示甲醇和SDS对蛋白酶催化活性的影响机理.【方法】利用酶促反应动力学方法,研究甲醇和SDS对蛋白酶催化活性的影响机理;通过对蛋白酶荧光发射光谱的测定,研究蛋白酶经甲醇和SDS溶剂微扰后的分子构象变化.【结果】甲醇和SDS对日本鳗鲡肠道蛋白酶均表现为失活作用,且失活作用都是可逆的;甲醇对蛋白酶的失活作用是属于非竞争性类型,而SDS的失活效应则表现为竞争性类型.蛋白酶经甲醇作用后荧光发射强度呈现减小现象,而经SDS作用后蛋白酶荧光发射强度呈增大现象,但荧光发射光谱的波长均没有发生变化.【结论】甲醇和SDS对日本鳗鲡肠道蛋白酶均具有失活作用,都是通过影响酶蛋白的空间构象而使酶失去催化活性的. 相似文献
118.
盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
为研究盐度对仿刺参(Apostichopus japonicus)蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响,通过考马斯亮蓝G250染色法间接测定仿刺参蛋白摄入量,福林-酚法测定仿刺参消化道蛋白酶活力。结果表明,在盐度为3.1%时,仿刺参蛋白摄入量最多,消化道蛋白酶活力最强;在盐度2.5%~3.1%范围内,随着盐度的升高,仿刺参蛋白摄入量和消化道蛋白酶活力逐渐升高;在3.1%~3.4%范围内,随着盐度升高,仿刺参蛋白摄入量和消化道酶活力均下降。盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响明显。 相似文献
119.
120.
[目的]明确肝片吸虫组织蛋白酶B4(CatB4)的分子特征及其免疫原性,为研究肝片吸虫CatB4蛋白的生物学特性及揭示其致病机理提供科学依据.[方法]通过RT-PCR扩增肝片吸虫CatB4基因,利用在线分子生物信息学软件对CatB4基因及其编码蛋白进行分子特征分析;构建原核表达载体pET-CatB4,经IPTG诱导获得融合蛋白后进行SDS-PAGE和Western blotting检测分析;并以融合蛋白CatB4免疫小鼠制备多克隆抗体,利用免疫组化对融合蛋白在肝片吸虫体内的表达进行定位分析.[结果]肝片吸虫CatB4基因片段为699 bp,其编码蛋白等电点(pI)7.95,理论分子质量25.89 kD,无信号肽和跨膜区,属于非分泌性蛋白;CatB4蛋白存在10个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点,有9个抗原决定簇,具有高度保守的CatB结构域,是由无规则卷曲连接9个α-螺旋和8个β-折叠构成其空间结构.基于CatB4基因核苷酸序列同源性构建的系统发育进化树显示,肝片吸虫和大片吸虫聚为一支,二者的同源性为83.98%.SDS-PAGE检测和Western blotting分析结果均显示在41.80 kD处能检测到目的条带.以纯化融合蛋白CatB4与弗氏佐剂乳化后免疫的小鼠均可产生特异性抗体,证实融合蛋白CatB4具有较强的免疫原性;免疫组化定位分析结果显示,在肝片吸虫的卵黄腺腺体细胞、排泄管上皮细胞、肠道上皮细胞和卵黄腺管上皮细胞均发生特异性的抗原抗体反应,呈深棕色.[结论]诱导表达获得的融合蛋白CatB4可特异性识别绵羊肝片吸虫阳性血清,具有较强的免疫原性,且主要在肝片吸虫分泌排泄组织器官中表达,说明CatB4蛋白具有作为肝片吸虫候选抗原的潜力. 相似文献