新加坡石斑鱼虹彩病毒 ICP46核输出信号序列的定位与功能鉴定

新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒, 可导致石斑鱼死亡率达90%以上, 给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。SGIV ICP46(infected cell polypeptides 46)是一个立即早期基因, 可能参与细胞的生长调控, 并对病毒复制有重要作用。在SGIV ICP46序列中存在一段富含亮氨酸(Leucine, L)的潜在核输出信号(nuclear export signal, NES)。为了深入研究该段NES序列在SGIV ICP46核转运过程中的作用, 实验构建了3个NES缺失的突变体: 仅含NES之前片段的突变体(ΔNESa)、仅含NES之后片段的突变体(ΔNESb)和不含NES的全长片段(ΔNESc), 并在真核细胞中表达, 观察这些突变体在细胞内的定位情况。转染细胞实验结果表明, 野生型EGFP-ICP46重组蛋白可以有效地被输出细胞核, 荧光信号主要分布在胞质区; 相反, NES缺失的EGFP-ICP46-ΔNES重组蛋白不能被有效地输出细胞核, 呈现与EGFP对照相同的泛细胞分布特征。突变实验证明, NES对SGIV ICP46输出细胞核具有决定性作用。     

刺五加水提物抗鳜蛙虹彩病毒活性及其对大口黑鲈免疫调节作用的研究

【目的】研究刺五加水提物(Acanthopanax senticosus aqueous extract, ASAE)对鳜蛙虹彩病毒(Mandarin ranavirus, MRV)的抑制作用及其对大口黑鲈免疫调节功能的影响。【方法】用不同剂量ASAE(1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL)与MRV同时作用鳜鱼脑细胞系(SCB3),检测ASAE对MRV的抑制活性。在基础饲粮中添加5‰ASAE,连续饲喂大口黑鲈15 d,实时荧光定量PCR和流式细胞术分析ASAE对大口黑鲈免疫功能的影响,并以1×10⁷ TCID₅₀/mL MRV腹腔注射攻毒,分析ASAE抗MRV保护效果。【结果】1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL ASAE对MRV抑制率分别为95.27%、91.36%、84.55%、60.05%、32.16%和2.49%。实时荧光定量PCR结果显示,ASAE诱导大口黑鲈白介素-10(interleukin-10,IL-10)、酪氨酸激酶(tyrosine-protein kinase, Lyn)、肌...     

我国养殖大菱鲆病毒性红体病及其流行情况调查

大菱鲆病毒性红体病(Viral reddish body syndrome,VRBS)是一种新发现的感染我国养殖大菱鲆的流行性疾病。本文描述了病鱼的外观症状和解剖病理特征,报道了该病的病原及疾病流行情况调查结果。外观检查发现,病鱼的体表无明显损伤,但腹面沿脊椎骨附近皮下淤血、发红,鳍及鳍基部充血、发红;病鱼贫血,血液凝固性差;肾脏肿大,呈灰白色。组织病理学研究显示病鱼脾组织中存在大量肥大细胞,电镜切片中可见大量平均直径约125nm的二十面体病毒粒子,即大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)。将过滤除菌的含TRBIV的病鱼脾组织匀浆液,经腹腔注射进行人工感染,感染鱼在3周内的累积死亡率达85．7％,死亡大菱鲆表现出腹面和鳍边发红等外观症状,并在感染鱼脾组织切片中观察到大量同样的病毒粒子,由此证实TRBIV是我国养殖大菱鲆病毒性红体病的病原。疾病流行情况调查显示,该病多在养成期大菱鲆中流行,高发季节为每年的8～12月。     

RNA干扰技术抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达

新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24～48h,实验细胞(共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46)和阳性对照细胞(共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46)中的荧光微弱,发荧光的细胞数量较阴性对照(共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46)少70%左右,但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强,在转染后72h其与阴性对照组已差别不大。说...     

桑叶水提物及异槲皮苷成分抗石斑鱼虹彩病毒作用机制研究

【目的】探究桑叶提取物成分对石斑鱼虹彩病毒（SGIV）的抑制作用,并对其抗病毒机制进行研究,为利用桑叶提取物成分研发抗SGIV药物提供理论依据,也为开发高效安全的新型抗病毒渔用药物提供新思路。【方法】利用石斑鱼脾脏组织细胞系（GS）,通过光学显微镜观察及CCK-8检测分析桑叶水提物（Morus alba L.water extracts,MAE）及其活性成分异槲皮苷（Isoquercetin,IQ）的安全工作浓度,然后使用实时荧光定量PCR及核酸适配体荧光分子探针技术（Q2-AFMP）分析MAE和IQ对SGIV的抗病毒效果;通过分析SGIV感染GS细胞中MCP基因和VP19基因的表达水平,分析IQ对SGIV的粒子结构及其与宿主细胞表面结合、侵入宿主细胞和在宿主细胞中复制的影响,探究IQ体外抗SGIV的作用机制。【结果】桑叶源化合物成分（MAE和IQ）对GS细胞的最高安全工作浓度为:MAE≤10.0 mg/mL,IQ≤1000.0μg/mL。与接入SGIV的GS细胞相比,在以安全工作浓度的MAE （10.0 mg/mL）和IQ （1000.0μg/mL）分别接入SGIV孵育感染的GS细胞后细胞病变（CPEs）明显减少,MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势（P<0.01,下同）,GS细胞荧光值也极显著降低,表明桑叶源化合物成分能有效抑制SGIV感染。以IQ处理SGIV孵育感染的GS细胞,其细胞内MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势,提示IQ能破坏SGIV的粒子结构,并干扰SGIV对宿主细胞的吸附、侵入和复制。【结论】MAE和IQ对SGIV具有良好的抗病毒效果,其中IQ能在病毒吸附、侵入和复制阶段发挥抗病毒作用,即桑叶源化合物成分在防治SGIV感染方面具有潜在的应用价值,可作为研发抗SGIV感染的有效药用成分。     

棘胸蛙虹彩病毒疫苗制备及免疫技术

对棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)进行疫苗制备,通过细胞盲传培养、无菌检验和PCR检测,确定0.1% β-丙内酯4 ℃灭活72 h、0.2%福尔马林37 ℃灭活72 h、1%二乙烯亚胺37 ℃灭活48 h后制备的疫苗安全有效。将制备疫苗对棘胸蛙进行体表喷雾和肌肉注射免疫后,进行血清抗体效价检测和免疫保护力测定。结果表明,注射0.2 mL疫苗组(病毒滴度为1×10⁷ TCID50·mL^-1)棘胸蛙21 d血清中和抗体效价最高达到380.2,相对免疫保护率达到80%,为最适的免疫途径。60 min喷雾组28 d时的最高抗体效价为320,相对免疫保护率为60%,可作为快速无损伤免疫的有效途径。     

科技

据了解,台湾行斑鱼苗养殖业成长受限于石斑虹彩病毒感染症,鱼苗损失率高达七成;这种病毒还会感染17种以上的经济养殖鱼类。台当局“渔业署”统计,台湾石斑鱼苗的年产量高峰期在1999年,达2．82亿尾,之后逐年降低,至2005年仪剩0．65亿尾。     

微流控芯片技术检测虾四种病原微生物方法的建立

针对虾的白斑综合征病毒、桃拉综合征病毒、黄头病毒和十足目虹彩病毒1的基因保守序列设计LAMP引物,将引物包被于芯片反应槽中,将微流控芯片技术与LAMP等温扩增技术相结合,建立针对这四种病毒的高效准确检测方法。用不同浓度的病毒阳性模板检测了建立的检测方法对4种虾病毒与另1种常见虾病毒的特异性,并对20份阳性和30份阴性虾组织样本的特异性、敏感性和重复性进行了临床对比验证实验。结果表明：本研究方法灵敏度高,特异性强,重复性好,各病毒间无交叉反应,为同时快速检测虾的四种病毒提供了技术手段。     

真鲷虹彩病毒引起养殖斑石鲷大规模死亡的研究

2017年8月,山东省烟台市某养殖场网箱养殖的斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼突然发病并大量急性死亡。疾病调查显示,养殖海域水温为26℃~28℃;病鱼为4~5月龄,全长为(16.3± 1.6) cm,体重为(156.9±37.0) g;80万尾斑石鲷幼鱼2周内累积死亡率达90%以上,经济损失惨重。临诊检查发现,病鱼体表无明显损伤,但活力差、呼吸急促。剖检可见病鱼脾肿大、质地脆、易碎,肾糜烂,肝有出血点。组织切片观察发现,病鱼脾、肾造血组织中可见许多直径约为20 μm的肿大细胞,肿大细胞内含有大量直径约为145 nm、呈六边形的病毒颗粒。用过滤除菌的病鱼脾组织匀浆液,腹腔注射感染健康斑石鲷,感染组14 d内累积死亡率达95%。人工感染病鱼表现出与自然发病鱼类似的外观症状,且在脾、肾组织切片中也可观察到大量的肿大细胞及相似的病毒粒子。使用特异性PCR引物,从自然发病鱼和人工感染病鱼的肝、脾和肾组织中均检测到鱼类虹彩病毒的高强度感染。克隆、测序得到了1362 bp的病毒主要衣壳蛋白基因(MCP),序列比对显示,该病毒的MCP序列与真鲷虹彩病毒(RSIV) RIE12-1的相应序列完全相同。构建的虹彩病毒系统发育树也显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群,是RSIV的一个分离株。本研究首次证实RSIV可以导致斑石鲷大规模死亡,研究结果为诊断和防治斑石鲷病毒病提供了重要参考。     

眼斑拟石首鱼暴发性传染病病原初步研究

1999年 8～ 10月广东沿海网箱养殖的眼斑拟石首鱼 (Sciaenopocellatus)流行一种暴发性传染病 ,经抗菌药或杀虫剂处理均无效。为查明病因 ,取病鱼镜检 ,未发现寄生虫 ,也分离不到细菌。电镜观察 ,可见病鱼的脾脏细胞内有截面为六边形、直径约 15 0nm的病毒颗粒 ,且脾、肝、肾都有一定程度的病变 ;用 2对日本所报道的虹彩病毒特异引物进行PCR扩增 ,在病鱼的脾脏样品中扩增出 2条大小与所报道的虹彩病毒扩增产物吻合的特征带 ,故初步认定虹彩病毒是眼斑拟石首鱼暴发性传染病的主要致病原