实时定量PCR检测技术研究进展

传统定量PCR检测方法如内参照法和竞争PCR法,因为在达到平台期后才能对其进行检测,由于PCR扩增已经过了对数期,其检测重复性相对较差.而实时荧光定量PCR技术可直接监测PCR过程中荧光信号的变化,以获得目的区段扩增产物定量的结果,直接可以进行定性分析和定量分析,操作简便无污染.本文通过对实时荧光定量PCR检测技术的原理、分类、方法和应用4个方面阐述实时定量PCR检测技术研究进展.     

黑杨三倍体与二倍体叶片中miRNA表达差异研究

本文以改进CTAB法提取的总RNA为模板,通过设计茎环反转录引物,利用定量RT-PCR技术从黑杨幼嫩叶片、成熟叶片中均检测到miRNA。结果表明,miR159、miR167、miR171、miR319在三倍体幼叶中表达量均高于二倍体,miR164在三倍体成熟叶片中的表达量高于二倍体表达量。除miR319外,其余miRNA与其相应的靶基因在二倍体和三倍体黑杨不同阶段叶片中表达的消长关系都较为典型。暗示这些miRNA 靶基因可能与黑杨三倍体的速生性状形成相关。     

珍珠豆型花生品种白沙1016核型分析

珍珠豆型花生白沙1016是重要的花生种质资源.利用高度保守的重复序列5S和45SrDNA作探针对白沙1016根尖细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)分析,发现两探针在白沙1016的12条染色体上能产生杂交信号,其中1对染色体长臂与短臂、2对染色体短臂、3对染色体长臂具有杂交信号.综合DAPI+染色带纹和染色体长度、臂比、面积等特征,可以将白沙1016大部分染色体区分开,为白沙1016的育种利用提供了染色体遗传分析基础.     

不同O/L值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

本研究以不同油酸/亚油酸比值（O/L比）花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因（FAD2）的表达进行相对定量分析。结果表明：FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。       

青藏高原几种高山植物的光合生理特性

以14种高寒草甸植物为材料,研究分析植物叶片的光合色素含量和叶绿素荧光参数,以探究高寒草甸植物适应青藏高原极端环境的光合生理机制。结果表明,黄花鸢尾(Iris pseudoacorus)、美丽风毛菊(Saussurea pulchra)、鹅绒委陵菜(Potentilla anserina)和天蓝苜蓿(Medicago lupulina)叶片的单位面积叶绿素含量分别比黄帚橐吾(Ligularia virgaurea)高284.83%、200.56%、171.35%和148.31%,叶片PSⅡ有效光化学量子产量分别高79.99%、73.94%、68.37%和63.90%,叶片PSⅡ实际光化学效率也具有相同的变化趋势;而黄花鸢尾、美丽风毛菊、兰石草(Lancea tibetica)和麻花艽(Gentiana straminea)叶片的单位叶面积类胡萝卜素含量分别比天蓝苜蓿高393.93%、348.48%、260.61%和233.33%,其叶片的非光化学猝灭也显著高于天蓝苜蓿;黄帚橐吾、珠芽蓼（Polygonum viviparnm）和柔软紫苑(Aster flaccidus)叶片的叶绿素a/b值高于2.91,能适应较强光照,而天蓝苜蓿叶片的叶绿素a/b值小于2.5,常生长于植被下层,说明植物能够通过调整光合色素含量和构成而合理有效地利用光能以适应特殊的环境条件。     

鸡Dazl基因的克隆及其亚细胞定位研究

为克隆鸡Dazl(Deleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能.提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL.采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48 h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况.结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870 bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99％,编码氨基酸完全一致.酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功.转染48 h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949 bp特异条带和59.7 ku的融合蛋白.荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核.     

GFP和YFP小鼠生长繁殖性能及血液生化指标的研究

在SPF级环境下,对神经系统转GFP和YFP基因荧光小鼠的生长繁殖性能和血液生化指标进行比较研究。选择10周龄GFP和YFP小鼠各30只（雌雄各半）,采取近亲交配繁殖（雌雄1：1）,并统计其生长繁殖性能,用全自动生化分析仪测定小鼠血清中15项生化正常指标。小鼠体重增长在雌雄间有差异而品种间无差异;绝大多数血液生化指标在雌雄间和品种间均无差异。两种小鼠的体格大小相当,产仔能力YFP小鼠强于GFP小鼠,正常血液生化指标主要受遗传基因控制。     

黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达水平

Boule基因是DAZ家族成员之一,在生殖细胞中特异表达是精子发生过程中减数分裂的关键调控因子,其表达缺乏可引起减数分裂阻滞和精子生成障碍,导致雄性不育。为揭示Boule基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育关系,本研究利用实时荧光定量PCR法,对黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达进行定量分析。结果表明:Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平相对都比较高,黄牛与牦牛差异不显著(P>0.05);而Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平显著高于犏牛,黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P<0.05)。结果提示,Boule基因在犏牛睾丸组织中低表达与犏牛雄性不育相关,可作为研究犏牛雄性不育的重要候选基因。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染早期体内增殖规律调查

为探讨高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染早期在猪体内的增殖规律,利用荧光定量PCR技术,检测HP-PRRSV经肌肉注射、气管接种后,外周血的全血、血清、外周血单个核细胞(PBMC)的Ct值,并计算其拷贝数。结果表明肌肉注射和气管接种两种方式均能对香猪感染成功,但与气管接种相比,肌肉注射能在外周血中先检测到病毒。同一只猪的全血和血清中的病毒含量差异不明显,但PBMC中的病毒含量却相对要少;HP-PRRSV感染后2～6 h,肌肉注射和气管接种后的病毒增殖都较慢,但肌肉注射更易检测到病毒;感染2 d后,气管接种组的病毒增殖迅速,明显高于肌肉注射的增殖速度;感染后2～6 d,外周血中的病毒迅速增殖,之后逐渐降低。气管接种组的临床症状比肌肉注射组的严重。     

雏鸡肠组织中CD44的鉴定及时空表达特性

为了解CD44分子在雏鸡肠组织内的表达及其时空表达特性,设计1对引物,建立RT-PCR方法对CD44mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡CD44基因表达水平的SYBR Green Ⅰ实对荧光定量(Q-PCR)方法,对1～28日龄商品鸡肠组织不同部位中CD44 mRNA表达水平进行检测.结果显示,从鸡肠组织中成功鉴定出CD44 mRNA,建立的荧光定量方法能特异性检测到CD44 mRNA,CD44和GAPDH基因的扩增效率分别为95％和101％,线性范围均在108～104拷贝/μL,敏感度高,最低检测限分别为45和77个拷贝.建立的CD44SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点.雏鸡不同日龄,不同肠组织中CD44表达水平有所差异,5～20日龄时的空肠组织和5～10日龄时的直肠组织中CD44表达量较高.