龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达

以龙眼体胚发生早期的胚性培养物为材料,通过简并引物结合PCR进行cDNA末端快速克隆(RACE)的技术,克隆到了龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5全长序列,其cDNA全长为887 bp,由681个核苷酸组成的开放阅读框,编码226个氨基酸(GenBank登陆号为GQ443759).该基因推导的蛋白分子质量为24511.9 u,理论等电点pI为9.65;该蛋白是Frigi-da-like蛋白质家族成员,是一个具有Frigida组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,并且主要集中在C端区域.实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,呈"N"形趋势,其中以不完全胚性紧实结构阶段最高,而鱼雷形胚阶段表达量最低;方差分析表明,鱼雷形胚阶段DlUP-5基因表达量与其他7个阶段存在极显著差异.该研究结果对DlUP-5基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼胚性愈伤组织胚胎发生能力、早期体胚正常发育和体胚成熟过程等方面可能起重要作用.     

广谱拮抗放线菌C28的鉴定及其对甜瓜蔓枯病的防治效果

【目的】研究放线菌C28对12种植物病原真菌的抑菌作用及对盆栽甜瓜蔓枯病的防治效果,并对该放线菌进行分类鉴定。【方法】采用琼脂块法、生长速率法研究放线菌C28对靶标病原真菌的抑菌作用;通过盆栽试验研究C28对甜瓜蔓枯病的防治效果;根据形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析确定C28的分类地位。【结果】①放线菌C28对供试病原真菌具有一定的广谱拮抗性,拮抗圈直径为10.0～22.5 mm;其无菌发酵滤液对病原真菌菌丝生长具有明显的抑制作用,无菌发酵滤液原液对木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、层出镰刀菌（F.proliferatum）及葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的抑菌率分别高达95.0%,90.0%及93.1%。②用放线菌C28无菌发酵滤液稀释10⁴倍处理甜瓜种子后,甜瓜胚轴、胚根长度较对照（无菌水处理）增加37.1%和12.5%;种子简明活力指数高达141.7,与对照差异显著（P<0.05）。③用C28无菌发酵滤液原液喷施处理后,甜瓜蔓枯病病情指数较对照显著下降（P<0.05）,预防和治疗效果分别为42.4%和40.0%。④根据形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,将放线菌C28鉴定为球孢链霉菌球孢亚种（Streptomyces globisporus subsp.globisporus）。【结论】球孢链霉菌球孢亚种C28对多种病原真菌具有广谱拮抗性,对甜瓜蔓枯病具有良好的抑菌和生防效果,对瓜类种子萌发和生长具有一定的促进作用。     

山羊Eda基因的克隆、序列分析及表达

【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对 mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176 bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A1少6个碱基（nt1161-1166）,编码389个氨基酸;山羊Eda蛋白氨基酸序列相似性在不同物种间均大于90%。SMART分析表明,CDS编码的蛋白质包含了TNF、跨膜区以及胶原等结构域。SWISS-MODEL软件预测结果表明,Eda-A2与Eda-A1在蛋白质表面结构上存在明显差异。毛囊退行期的皮肤组织中,Eda mRNA表达量最高,且极显著高于毛囊休止期和毛囊生长期（P＜0.01）,毛囊生长期的表达量中等且显著高于休止期（P＜0.05）,毛囊休止期的表达量较低。【结论】Eda基因CDS区在物种间保守性较强,Eda mRNA在毛囊生长周期不同阶段表达量有差异,推测Eda基因对毛囊生长周期的调控有一定影响。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（BdorSer）的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer）,研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239 bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）丝氨酸蛋白酶（登录号XP_001352960）氨基酸序列的一致性最高,为65.8%。实时荧光定量PCR分析表明,BdorSer mRNA在桔小实蝇雌雄虫的不同组织中都有表达,且在触角中的表达量最高,分别是雌虫胸部的43.6和26.8倍。BdorSer mRNA在生殖节中表现出较大的性别差异表达特征,雄虫生殖节中的mRNA表达量是雌虫的18.25倍。BdorSer mRNA几乎在昆虫发育的各个时期都有表达,其中在卵及1,2,3龄幼虫中的表达量分别是10 d 蛹的 0.68,1.63,4.31和15.8倍。BdorSer mRNA随蛹的发育其表达量逐渐减低,1,4,7 d蛹中的表达量分别是10 d蛹的325,125和41倍。【结论】克隆获得了BdorSer,其表达的BdorSer蛋白可能在雄虫的生殖生理中发挥了作用,同时也可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其是1 d蛹的发育过程。     

千年桐种源间叶绿素荧光特性的比较

以不同种源千年桐叶片为试验材料,测定叶绿素荧光参数Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、Yield、qP和qN,结果表明:不同种源千年桐叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm、Fv/Fo、qP值均存在极显著差异,Yield值存在显著差异.参数Fv/Fm、Fv/Fo、Yield是林木光合效率的重要依据,其中莆田种源的三值均较高.据千年桐不同种源荧光参数综合指标投影值的计算结果,6个种源的优劣排序为:莆田>建阳>尤溪>顺昌>沙县>政和.结合叶片SPAD值、苗木的苗高和地径以及叶片的叶绿素荧光参数综合考虑,千年桐的早期选择可以优先考虑莆田种源、建阳种源和尤溪种源.     

氮磷钾施肥配比对骏枣叶绿素荧光参数的影响

【目的】揭示骏枣的叶绿素荧光参数对氮磷钾在不同施肥时期施肥配比的响应机制。【方法】以新疆阿克苏地区3年生骏枣为试验材料,均株施N 0.440 kg、P₂O₅ 0.368 kg、K₂O 0.079 kg,按不同量分别于萌芽期、花期和果实膨大期施入,共组成A、B、C、D 4个氮磷钾施肥配比,以萌芽期施入尿素和磷酸二铵混合肥（质量比为1∶2.5）0.4 kg/株为对照,采用Handy PEA 植物荧光效率仪测定花期和成熟期骏枣叶片的荧光参数,研究氮磷钾施肥配比对其叶绿素荧光参数的影响。【结果】4种施肥配比的叶绿素荧光参数日变化趋势基本一致,在骏枣花期和成熟期,初始荧光（F₀）均大致呈现先上升后下降的变化趋势,而最大荧光（Fm）、PSⅡ最大光能转化效率（Fv/Fm）、PSⅡ最大光能转化潜力（Fv/F₀）总体呈现先下降后上升的变化趋势;4种施肥配比方案对骏枣的F₀、Fm、可变荧光（Fv）和Fv/Fm影响差异显著,花期F₀、Fm和Fv的顺序为C配比>B配比>A配比>D配比,Fv/Fm的顺序为D配比>C配比>A配比>B配比;成熟期F₀的顺序为C配比>A配比>B配比>D配比,Fm和Fv的顺序为D配比>C配比>B配比>A配比,Fv/Fm的顺序为D配比>B配比>C配比>A配比。【结论】不同施肥方案比较结果显示,采用D配比（萌芽期施氮0.176 kg/株、磷0.123 kg/株、钾0.040 kg/株,花期施氮0.132 kg/株、磷0.123 kg/株、钾0 kg/株,果实膨大期施氮0.132 kg/株、磷0.123 kg/株、钾0.040 kg/株）时骏枣的最大荧光产量和PS Ⅱ 光能转换效率及PS Ⅱ 电子传递活性最高,说明在氮磷钾施用总量相同的情况下,于花期和果实膨大期追施磷钾肥能够改善骏枣的光合功能。     

干旱胁迫下转 CSPs 基因油菜和非转基因油菜生理生化变化的比较研究

以转冷激蛋白(Csps)基因油菜与非转基因油菜为材料,在自然干旱条件下进行胁迫试验,比较研究了转 CSPs 基因油菜与非转基因油菜幼苗干旱胁迫下的耐受性应答情况.在干旱胁迫下,转 CSPs 基因油菜的叶片含水量、蛋白质含量比非转基因油菜的高,而丙二醛含量明显低于非转基因油菜;胁迫期间,油菜叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性有不同程度的增加,与非转基因对照相比,转基因油菜幼苗叶片的抗氧化酶活性普遍高于对照.对干旱期间油菜叶片的叶绿素荧光进行分析,发现转基因油菜叶片的初始荧光 F0上升趋势和最大光化学量子产量 Fv/Fm 的下降趋势均显著高于非转基因油菜.以上结果表明,CSPs 作为一种分子伴侣,广泛参与了油菜幼苗对干旱胁迫的耐受性应答过程,从而增强了植株的耐旱能力     

GFP标记的短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）转座突变株的构建初探

以水稻叶面附生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus)为研究对象,通过构建pMOD-egfp-Tetr转座复合体,采用电击转化法对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的转化子。对转化子进行了遗传稳定性分析和分子鉴定,并且在荧光显微镜下观察到了强烈的绿色荧光,研究结果表明外源DNA已经成功整合进细菌的基因组中,gfp基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达。     

SPE-HPLC/FLD法同时测定水中4种雌激素

研究建立了固相萃取(SPE)-高效液相色谱仪(HPLC)-荧光检测器(FLD)测定水体中4种雌激素(雌三醇、17β-雌二醇、炔雌醇和双酚A)的分析方法.水样过C18固相萃取柱净化浓缩,用5.00 mL超纯水淋洗,15.00 mL甲醇洗脱,洗脱液经氮气吹干后用50％甲醇溶解经HPLC-FLD测定;4种雌激素以甲醇/乙腈/水为流动相(体积比为25:30:45),经Inertsil ODS-SP-C18(150 mm ×4.6mm,5 μm)反相色谱柱分离,激发和发射波长分别为280 nm和310 nm,流速1.0 mL· min-1,柱温40℃,进样量20 μL,以保留时间定性、外标法定量.该方法的线性范围为5.00～1000.00 μg·L-1,且相关性良好(R＞0.9999),4种雌激素的仪器检出限为0.107 ～0.271μg·L-1,方法检出限为0.214～0.540 ng· L-1.在自来水中添加不同浓度的雌激素混合标准溶液,测得溶液中4种物质的加标回收率除炔雌醇为55.71％～66.78％外,其余雌激素的加标回收率均大于85％,相对标准偏差RSD(n=5)均小于4％.该方法灵敏度高、检出限低、重复性和精密性良好,能有效去除基质干扰,可用于水体中痕量雌激素的分析测定.