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71.
采用PCR方法从鲁西黄牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a+中,构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α,进行测序和诱导表达.测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498 个核苷酸,含1个开放阅读框(ORF),编码166 个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%.表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%.表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后免疫昆明系小鼠2次,制备高滴度的牛IFN-α抗血清.结果从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-α C2,实现了高效表达和纯化,并制备了鼠抗牛IFN-α,为重组牛干扰素的开发奠定了基础. 相似文献
72.
73.
猪瘟活疫苗(种毒)鉴别检验阳性血清制备 总被引:1,自引:0,他引:1
为制备猪瘟活疫苗(种毒)鉴别检验阳性血清,本实验将4头非免疫健康猪进行猪瘟活疫苗基础免疫和猪瘟石门强毒株反复强化免疫后,采血分离血清,过滤、分装、冻干、熔封,获得4批产品,并进行了检验和验证。结果显示:物理性状、无菌检验、安全检验、均一性检验、支原体检验、真空度测定均合格;剩余水分均小于4%;特异性检验表明,口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒抗体均为阴性;残余猪瘟病毒免疫荧光和套式RT-PCR核酸检测结果均为阴性;兔体中和效价分别为1∶800、1∶800、1∶800和1∶1 600;对猪瘟兔化弱毒种毒和5种猪瘟活疫苗的验证结果均良好。该4批血清可以用于猪瘟活疫苗(种毒)鉴别检验。 相似文献
74.
本研究合成并鉴定了黄曲霉毒素M1人工抗原,通过动物免疫制备出敏感性高、特异性好的鼠源黄曲霉毒素M1多克隆抗血清。采用琥珀酸酐改造黄曲霉毒素M1,并将其改造物按两种方法(DCC和EDC)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,合成免疫抗原AFM1-BSA和检测抗原AFM1-OVA,经过薄层色谱、紫外扫描和凝胶电泳鉴定后,免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔3周,最后1次免疫10d后,断尾采血,制备多抗血清。经过测定,免疫的3只小鼠效价均达到了1:104以上,2号小鼠多抗血清的敏感性最好,半数抑制浓度IC50(50%inhibitive concentration,IC50)为37.61ng/m L,且具有良好的特异性。本研究成功合成了黄曲霉毒素M1人工抗原和多克隆抗体血清,为黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
75.
76.
棉铃虫氨肽酶N基因片段克隆、表达和内源蛋白检测 总被引:1,自引:0,他引:1
氨肽酶N(APN)是苏云金芽孢杆菌杀虫毒素Cry在昆虫中肠中的一个重要受体。研究氨肽酶N在昆虫中肠中的分布特征对于阐明Cry毒素的杀虫机理和昆虫对Cry毒素的抗性机理具有重要的意义。通过RT-PCR的方法从棉铃虫中肠上皮细胞中克隆得到氨肽酶N的基因片段APN1551,并诱导表达纯化得到其重组蛋白APN517。以此蛋白为抗原,制备其抗血清。用该抗血清能检测到棉铃虫中肠上皮细胞中的APN蛋白。为研究Cry毒素的作用机理奠定基础。 相似文献
77.
西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)是危害葫芦科作物的重要病毒。制备特异性强、效价高的抗血清对快速准确检测和鉴定WMV具有重要意义。本研究将WMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV获得pEHISTEV-WMV-CP。将pEHISTEV-WMV-CP转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,成功表达出分子量约为36 kDa的蛋白,与预期WMV CP大小一致。切胶回收WMV CP,与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫健康新西兰大白兔。Western blotting结果表明,制备的抗血清与WMV CP有反应,与同属的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)均无反应。酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)结果表明,本研究制备的WMV抗血清效价为1∶8 192,并且能够检测稀释512倍的病毒汁液。利用该抗血清对田间采集的10个RT-PCR检测为阳性的样品进行检测,全部呈现阳性。本研究利用大肠杆菌表达的CP制备的WMV抗血清具有较高的特异性和灵敏度。研究结果为WMV的快速检测和鉴定奠定了基础。 相似文献
78.
嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析 总被引:3,自引:0,他引:3
以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93.1%-95%之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量约57.4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50%以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot,在57.4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1:12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学,2008,15(2):301—306] 相似文献
79.
80.
根据烟草蚀纹病毒(TEV)CP序列设计合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了TEV CP基因,大小为789 bp。将TEV CP基因克隆到pM D 18-T S im p le V ector,经E coRⅠ/S acⅠ双酶切得到目的片段,并将其定向插入到pET 30a载体中构建了原核表达载体pET 30-TEV CP,重组质粒经E coRⅠ和S acⅠ双酶切鉴定及基因测序验证正确后,转化大肠杆菌BL 21,用IPTG进行诱导表达。结果表明,TEV CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,分子量约为37 ku。以表达产物为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,其效价为1/1 204。W estern b lot检测结果表明,制备的抗血清可用于检测田间的发病植株。 相似文献