副溶血弧菌对斑节对虾和日本对虾的致病力研究

作为条件致病菌的弧菌,前人对其致病性已作了大量的研究,但不同研究者得出的结果很不一致,有的甚至相互矛盾［1－4］,其差异主要在于浸泡感染能否使健康对虾致病。因此,本实验以不同的感染方式以及不同的实验条件,对斑节对虾体内分离出的副溶血弧菌的致病力进行研究,以便了解对虾弧菌病的发病条件。１材料与方法１.１材料 对虾：体长７～９ ｃｍ的健康斑节对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｎｄｏｎ）和日本对虾（Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）,直接购于养殖场。 菌株：对虾病原菌一副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｏｒａ－ｈａｅｍｏｌｙｔｉ…     

溶藻弧菌单克隆抗体的制备及应用

小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0与经溶藻弧菌(1.1587)免疫的BALB3/C雌鼠脾细胞在PEG条件下融合,有45.8%的培养孔有杂交瘤细胞生长,其培养上清液抗体阳性率为77.4%.经反复有限稀释法克隆杂交瘤细胞,获得7株抗溶藻弧菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为AC1-C9,AC1-C11,BB4-D4,AD1-A3,AD1-F3,AD2-E7,AD2-F7.取AD1-F3扩大培养,注射小鼠,制备了抗溶藻弧菌的单克隆抗体腹水,滴度为11000.该腹水与其他3株溶藻弧菌菌株有强交叉反应,与其他13株标准菌株无交叉反应.利用制备的单抗腹水,建立了检测溶藻弧菌的单抗-ELISA技术.该反应系统可应用于溶藻弧菌的快速诊断,反应时间为6-7h,检测灵敏度为104cells·-1.并利用该检测方法进行了11份待测菌样本溶藻弧菌的检测.     

魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表达分析

通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素(C-type lectin,Sb-Lec1)基因,该基因全长为700 bp,其中,5′-UTR为29 bp,3′-UTR为167 bp,开放阅读框长度为504 bp,编码167个氨基酸,包括长度为23个氨基酸的信号肽序列、129个氨基酸的糖识别结构域(CRD)以及参与二硫键形成的6个半胱氨酸。预测蛋白分子量为19.11 k Da,理论等电点为4.74。多序列比对结果显示,Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与长牡蛎(Crassostrea gigas)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和海湾扇贝(Argopecten irradians)C型凝集素的同源性分别为38%~40%、34%~35%和38%~39%,Sb-Lec1基因编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构,均含有形成二硫键的4个保守半胱氨酸。系统进化分析结果显示,魁蚶先与贝类聚为一支,再与脊椎动物聚在一起,表明魁蚶Sb-Lec1基因在进化树上的位置与其传统分类所处位置一致。采用荧光定量PCR技术,检测了Sb-Lec1基因在组织中的表达情况,发现其在肝胰腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、斧足中均有表达,其中,肝胰腺表达量最高。同时,分析了Sb-Lec1基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的mRNA表达量变化情况。结果显示,与对照组相比,菌刺激组Sb-Lec1基因mRNA在各检测组织中的表达量均显著上调(P0.05),随着刺激时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势。本研究表明,魁蚶Sb-Lec1基因在机体免疫防御方面发挥重要功能。     

悉生条件下3株嗜盐古菌对卤虫生长及其抗弧菌感染的影响

嗜盐古菌存在于高盐水体中,是高盐环境微生物种群的重要组成部分。本研究利用从日晒盐场结晶池卤水中分离得到的3株红色嗜盐古菌,分别命名为Haloarcula sp.HG-1、Haloferax sp.KN-4和Halorubrum sp.IT-5。采用悉生实验系统,探讨不同盐度(30、100和150)条件下3株古菌能否作为卤虫(Artemia)的唯一饵料,并比较其作为饵料对卤虫存活、生长和抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染能力的影响。结果表明,在盐度30的悉生系统中,投喂3株古菌组卤虫存活率和体长均保持较高水平;鳗弧菌攻毒条件下,卤虫存活率有所下降,其中投喂Haloferax sp.KN-4菌株组卤虫抗鳗弧菌感染能力最强。正常和攻毒条件下,在盐度100和盐度150悉生系统中分别投喂3株古菌,卤虫均保持较高存活率和体长,其中投喂Haloarcula sp.HG-1菌株组卤虫具有最高存活率和最长体长,但攻毒组卤虫存活率和生长普遍优于未攻毒组,这可能与高盐条件下V.anguillarum毒力下降有关。本研究利用"卤虫-古菌"悉生实验系统,证实了3株嗜盐古菌均可作为卤虫的唯一饵料,为卤虫提供营养;利用"卤虫-古菌-致病菌"攻毒实验系统,证实3株嗜盐古菌均可以增强卤虫抗鳗弧菌感染能力。本研究结果为研究古菌在高盐环境食物链中的作用提供了基础数据。     

海水网箱养殖高体Shi弧菌病致病菌研究

从患病高体Ｓｈｉ病灶上分离到７株可疑致病菌，人工感染试验证明，菌株９５－５－３和９５－５－５为强毒菌株，这２株菌进行人工感染，死亡率均为１００％，症状与自然发病相似。这２株菌的特征一致，根据形态有主生理生化特征，应归入哈维氏弧菌。药敏实验的结果表明，磺胺类药物和先锋必素对致病菌有较强的抑制作用。     

中国对虾病原菌(鳗弧菌)的研究

1987年7～10月福建省平谭县对虾养殖场发生了一起严重的流行病。病虾活动力减弱,食欲下降,个体消瘦,头胸甲心区附近呈白色或浅桔红色,血淋巴液稀薄、混浊、不能凝固。因病虾步足、游泳肢及尾扇呈鲜红色,被称为“红腿病”。死亡率可高达90％以上。从五只垂死病虾的心脏血淋巴液中分离到细菌作纯焙养,经肌肉注射和浸泡的人工感染方法,得到了与虾池中患病虾相同的症状。菌原菌是革兰氏阴性短杆鼠。以极生单鞭毛运动。发酵葡萄糖,产酸不产气。氧化酶、过氧化氢酶阳性。能还原硝酸盐成亚硝酸盐。精氨酸脱羧;鸟氨酸、赖氨酸不脱羧。V.P.阳性.在42℃中不能生长。不能在无盐和含有8％NaCl 的胨水中生长,但在含有3％和6％NaCl的胨水中生长良好。对弧菌抑制剂0/129敏感。经鉴定为鳗弧菌(Vibrio anguillarum Bergman)。     

1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析

从养殖的患病军曹鱼身上分离出1株病原菌JT2，革兰氏阴性，短杆状，有极生鞭毛，能运动，菌落半透明。经回归感染实验，证明该菌为军曹鱼病原菌。进行了常规生理生化实验，并用API-ID32E系统鉴定该菌。再经Biolog-GN细菌鉴定系统鉴定，结果JT2与鲨鱼弧菌（Vibrio carchariae）相似度最高。为了进一步确定该菌的分类学地位，测定了其16SrDNA序列，分析了相关细菌的同源性，构建其系统发育树。结果表明，该菌株与V．carchariae的亲缘关系最近。综合上述几种方法的鉴定结果，最后鉴定该株菌为鲨鱼弧菌V．carchariae。     

青岛陆源排污口邻近海域异养细菌的组成与分布

对青岛近海度假区、港口区、养殖区、工业区4类排污口邻近海域异养细菌的组成与分布进行了调查研究,采用海洋异养细菌平板涂布培养法分离细菌,基于16S rDNA的扩增性DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)进行聚类筛选并测序鉴定。结果显示,青岛排污口邻近海域可异养培养的菌株分布于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个细菌类群,变形菌门细菌数量占总测序数量的68%,其中γ-变形菌纲的数量在变形菌门中占88%;不同海域中细菌组成与分布有所不同,放线菌门和拟杆菌门的细菌种类较少且各海域分布有所不同,但γ-变形菌纲的弧菌属细菌(Vibrio sp.)在4类海域中均被发现,占总检测量的18.54%,其中溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)占弧菌总量的25%。不同海域也检测到V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.campbellii、V.parahaemolyticus等水产养殖业的潜在致病菌。根据16S rDNA系统进化关系和细菌门类聚类分析得到的结论推断,工业区与养殖区海域的细菌组成和分布相似度较高,推断各海域的细菌组成与排污口类型有一定相关性。     

一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD₅₀为2.07×10~6 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V.rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

养殖大菱鲆肠道中大菱鲆弧菌的分离鉴定及药敏试验

2014年11月,大连地区某大菱鲆养殖场发生病害并伴有死亡,主要症状为吻部下颌明显出血,腹腔积水,肝脏充血,肠道出血有白便。从患病大菱鲆肠道中分离出1株可在硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基上生长的菌株HZ-C1,人工回接感染试验证明其对健康大菱鲆具有较强致病性。通过形态学观察、16SrDNA序列同源性分析及生理生化试验确定菌株HZ-C1为大菱鲆弧菌。药敏检测结果显示,大菱鲆弧菌HZ-C1对氯霉素、丁胺卡那及头孢曲松等11种抗生素敏感,但对青霉素、四环素及诺氟沙星等15种抗生素耐药。本研究为大连地区养殖大菱鲆细菌性病害防治提供了一定病原学依据。