低磷胁迫下茶树根系CS基因的克隆及表达分析

柠檬酸合成酶（Citrate Synthase, CS）是茶树体内合成柠檬酸的关键性酶。克隆了茶树根系柠檬酸合成酶基因片段,GenBank登录号为FJ814766,且利用半定量RT-PCR方法,研究该基因在低磷下的表达变化。结果表明,当供磷浓度为0（缺磷）时,根系CS基因的表达略有增强,这可能是茶树对低磷的一种适应机制。     

利用实时荧光定量PCR 技术检测油菜菌核病菌

 采用高通量实时荧光定量PCR 技术建立检测和监测油菜菌核病菌群体数量的方法。利用油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的茁-微管蛋白基因内含子序列的特异性,设计引物对SclSF (5'-CTCAAATCTCCGAAAGTT -3') / SclAF (5'-TGCAGACGGGTAATATG -3'),建立和优化了SYBR Green 玉实时荧光定量PCR 检测体系。结果表明,该引物对能够从8种所测试的十字花科植物常见病原真菌中特异性扩增出油菜菌核病菌;所建立的实时定量PCR 技术可应用于油菜病叶和病茎中菌核病菌的早期检测及菌核病的预测预报。     

珠美海棠MzWRKY基因家族盐胁迫应答模式研究

对苹果属植物现有的58个WRKY 的EST序列进行分析,得到了37条uniESTs。珠美海棠（Malus zumi Mats）是耐盐的优良苹果砧木,能在土壤全盐含量为0.6%的盐碱地上存活。根据已知的37条uniESTs序列,通过半定量RT-PCR研究了珠美海棠中MzWRKY基因家族的盐应答模式。28个MzWRKY基因能检测到RT-PCR的产物,其中21个基因受盐诱导,1个受盐抑制。根据MzWRKY基因盐应答模式可将这些基因分为两组,基因表达模式的差异说明MzWRKY在珠美海棠的盐应答中角色的多样性。     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析#br#

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号：GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号：GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72 bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

苹果属观赏海棠McCHS基因的克隆及实时定量表达

以苹果属观赏海棠‘王族’品种叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1529bp的查尔酮合成酶(Chalcone sythase,CHS)基因的cDNA序列,其基因编码区共1167bp,编码389个氨基酸,命名为McCHS。使用实时荧光定量PCR和紫外可见光分光光度计,对3类不同叶色的观赏海棠品种‘火焰’(Malus‘Flame’,叶片绿色)、‘绚丽’(Malus ‘Radiant’,新叶红色)、‘高原之火’(Malus ‘Prairifire’,新叶红色)和王族(Malus ‘Royalty’,叶片紫色)幼叶和功能叶中的McCHS表达及其花色苷含量进行测定分析,结果表明:McCHS在4个品种的幼叶和功能叶中均有表达,其幼叶表达量的变化与叶片中花色苷含量的变化一致;除‘绚丽’外的功能叶表达量变化和花色苷含量变化也一致,‘绚丽’功能叶的特殊情况可能涉及花色苷合成途径中的其他酶和转录因子。     

莱芜猪和杜洛克猪肌肉H-FABP基因表达量与肌内脂肪和脂肪酸含量关联分析

旨在研究莱芜猪和杜洛克猪间肌肉H-FABP基因mRNA表达差异,同时分析H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪和脂肪酸含量的相关性,探索莱芜猪肌内脂肪沉积的分子机理.试验选择100 kg体重莱芜猪10头、杜洛克7头,采用荧光定量RT-PCR法测定H-FABP基因mRNA表达丰度,并测定肌内脂肪和脂肪酸含量.结果表明,莱芜猪背最长肌H-FABP基因mRNA的表达量比杜洛克猪高36.16%.莱芜猪和杜洛克猪肌肉H-FABP基因mRNA的表达量与肌内脂肪含量相关显著,H-FABP基因mRNA的表达量和肌内脂肪含量与饱和脂肪酸、饱和+单不饱和脂肪酸含量相关显著,莱芜猪H-FABP基因mRNA的表达量和肌内脂肪含量与多不饱和脂肪酸含量相关显著,与脂肪酸总量相关不显著,但是杜洛克猪则与此相反.莱芜猪和杜洛克猪肌肉H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪和脂肪酸组成相关显著,该基因可作为莱芜猪肌内脂肪选育的候选基因.     

小麦与叶锈菌互作过程中TaCDPKs的表达分析

根据NCBI上公布的14个TaCDPK基因序列分别设计特异引物,将小麦品种‘洛夫林10’分别与叶锈菌生理小种260和165组成不亲和组合与亲和组合,在接菌后不同时间点分别取样,利用实时定量PCR技术检测14个TaCDPK基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达谱。结果显示,14个TaCDPK基因的表达模式可分为4类:TaCPK1、TaCPK2、TaCPK6、TaCPK7在叶锈菌侵染早期2个组合中的表达量均明显升高;TaCPK3、TaCPK18、TaCPK19在叶锈菌侵染早期2个组合中的表达量均明显下降;而TaCPK5、TaCPK8、TaCPK9、TaCPK12、TaCPK13、TaCPK15的表达量在不同组合中随接种时间的延长变化不明显;另外,TaCPK4在2种组合中前期表达量并无明显差异,但是接种后48h在不亲和组合中的表达量明显升高,而亲和组合中的表达量基本没有变化。结果表明,TaCPK1、TaCPK2、TaCPK6、TaCPK7、TaCPK3、TaCPK18、TaCPK19、TaCPK4可能参与小麦抵抗叶锈菌侵染过程;而TaCPK5、TaCPK8、TaCPK9、TaCPK12、TaCPK13、TaCPK15在小麦抗叶锈菌侵染中可能不起作用。     

猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

试验根据猪链球菌2型荚膜多糖（CPS）抗原设计CPS2J基因特异性引物,建立猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.073x+36.87,r=0.995,熔解曲线只有单一的特异峰。敏感性试验显示,该方法可以检测出模板最低浓度为1.0×10¹拷贝/μL,是普通PCR的10倍;特异性试验显示,对猪链球菌2型具有良好的特异性,能够区分其他血清型猪链球菌和其他细菌;重复性试验变异系数为0.37%~0.63%,均低于2.5%。临床检测显示该方法的敏感性明显高于常规PCR方法和细菌分离的方法。以上结果表明,本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好,有利于对猪链球菌2型的快速检测。     

葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus,GFLV）RNA2序列设计4对特异性引物,通过引物筛选、体系优化,建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998,灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%,显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,最高含量是最低含量的81 245.5倍,与ELISA和巢式RT-PCR相比,实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。     

南瓜肌醇单磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆与表达分析

以中国南瓜（Cucurbita moschata）为试验材料,利用同源克隆和南瓜转录组unigene序列获得2个IMP基因的全长cDNA序列,将两个基因命名为CmIMP1和CmIMP2,GenBank登录号为KP735607和KP735608。CmIMP1基因cDNA全长1 053 bp,包含1个810 bp的ORF,共编码269个氨基酸;CmIMP2基因cDNA全长945 bp,包含1个807 bp的ORF,共编码268个氨基酸。序列分析发现两个基因均含有磷酸酶家族锂敏感的3个特殊结构域,系统进化树分析表明这2个南瓜CmIMP与其他植物IMP有较高同源性（63.8% ~ 94.0%）,并与葫芦科作物最接近。采用荧光定量PCR研究CmIMP在各组织及逆境条件下的表达模式显示,其表达具有组织特异性,在叶中表达最高,须和幼果次之;盐胁迫和干旱胁迫可强烈诱导CmIMP表达,ABA对CmIMP的诱导较微弱,推测CmIMP在南瓜响应非生物胁迫的分子调控机制方面发挥重要作用。