PCV2感染猪血管内皮细胞相关免疫调节分子的表达变化

将猪圆环病毒2型(PCV2)接种猪血管内皮细胞(VEC),于接种后不同时间收集细胞及上清,利用实时荧光定量PCR和ELISA技术分析VEC相关免疫调节分子表达变化。与对照组相比,PCV2感染后血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的mRNA水平变化趋势基本一致,VEGF和M-CSF在感染后12h显著上调,IL-6与M-CSF在48h显著下调;MCP-1和IL-8在感染后4h和48h均显著上调,且IL-8在24h时上调显著,72h下调显著。蛋白水平上,VEGF在4h显著下降,24h显著增高;IL-8在4h和24h显著上升。以上结果表明,PCV2体外感染导致VEC免疫调节功能分子表达异常,其炎性趋化、黏附能力以及对树突状细胞(DC)的分化、成熟等免疫调节功能可能受到影响。     

黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Dazl基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Dazl基因mRNA表达水平。利用GenBank中牛Dazl mRNA序列,在其保守区设计并合成特异性引物,以牛肌动蛋白基因(β-actin)为内参,建立实时荧光定量PCR方法。结果表明,在100～10-6 7个拷贝量重组质粒稀释范围内,Dazl和β-actin基因的Ct值与重组质粒的含量均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.999。熔解曲线产物为特异的单峰,具有较高的灵敏度和特异性。Dazl基因重组质粒最小检出含量达到10拷贝/μL,批内变异系数保持在1.351%以内,批间变异系数保持在3.217%以内,重复性较好。Dazl基因的mRNA表达量在犏牛睾丸组织中最低,这一分布可能与犏牛精子发生过程中减数分裂调控作用相关。     

盐胁迫下己唑醇铜配合物对小麦幼苗脯氨酸合成的影响

以己唑醇为配体与醋酸铜配合获得元素组成异化的己唑醇铜配合物。配合物对小麦种子浸种处理,待萌发生长至幼苗阶段将其进行NaCl胁迫处理,通过对幼苗脯氨酸含量以及脯氨酸合成酶基因P5CS、P5CR表达变化的测定,评价己唑醇铜配合物对植物抗盐能力的影响。结果表明：小麦幼苗脯氨酸含量随着盐浓度的增大及胁迫时间的延长而增加,200 mmol·L^-1 NaCl胁迫下,配合物处理后脯氨酸含量最高,达55.44 μg·g^-1,相比己唑醇和醋酸铜处理分别增加13.68%和58.45%;而100 mmol·L^-1 NaCl处理6 h,己唑醇铜配合物处理小麦幼苗的脯氨酸合成增幅最大,P5CS、P5CR表达量明显增加,在一定程度上缓解了小麦幼苗的渗透胁迫伤害。     

农业女性化综合评价指标体系研究

构建并运用一套科学合理的评价指标体系,不仅是准确判断农业领域中女性从业现状的基础,也是成功预测农村女性农业从业趋势的关键。加强农业女性化现象的实证研究,需要立足于科学的评价指标体系,而合理选择农业女性化的测量维度是构建科学评价指标体系的前提条件。从农村女性的劳动参与率、经济贡献率、生产决策权、农业科技知识和技能4个方面出发,既可以多维度考察农业女性化现象,也可以较为全面地掌握和评估妇女在农业生产中的地位与作用。这4个方面即构成农业女性化评估对象或内容,并在此之下分别设立一级指标和二级指标。依据测评指标体系获得的数据调查资料,可以运用主成分分析法进行实证分析。     

芒果细菌性角斑病菌在侵染芒果叶片过程中内参基因筛选

为筛选芒果细菌性角斑病菌在侵染芒果叶片过程中稳定表达的内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式扩增反应技术检测和分析病原细菌的16S rRNA、gyrB、GAPDH、dan K和rpo D这5个看家基因的表达量。结果表明,经过PCR扩增效率筛选,5个基因均扩增出单一条带,且条带大小与预期产物相符,特异性较好,符合基本稳定性要求。利用ge Norm软件分析发现,GAPDH和rpo D稳定性最高,M值均为0.122。其余3个基因的表达稳定性依次为gyr B (M=0.17)dan K (M=0.325)16S rRNA (M=0.542)。在5个候选内参基因中,GAPDH和gyr B为病原细菌侵染芒果叶片下表达最稳定的基因,且不需要引入第三个基因(V_(2/3)=0.063)。NormFinder软件分析5个候选内参基因稳定性数值顺序依次为:gyr B (0.092)dan K (0.169)GAPDH(0.188)rpo D (0.235)16S rRNA (0.581)。Bestkeeper程序分析5个候选内参基因的标准差(SD)值都在0.86～0.79之间。综合以上结果发现GAPDH和gyr B基因的表达稳定性最好,能够作为病原细菌在侵染芒果叶片时的内参基因,更准确地校正定量结果。     

甜瓜化感自毒作用响应基因的cDNA-AFLP分析

本研究以甜瓜种质"新银辉"为试验材料,利用浓度为0.03 g.mL 1的新鲜甜瓜植株水浸提液处理甜瓜幼苗,通过cDNA-AFLP技术分析甜瓜化感自毒作用相关基因及其表达情况。试验中利用82对引物进行扩增,共获得3 600多条差异表达转录衍生片段(TDFs),平均每个引物组合可扩增出30~50条条带,片段大小集中在50~800 bp之间,根据条带强弱和有无的变化,其表达模式可以分为持续表达、瞬时表达、上调表达和下调表达4种情况。选取其中103条TDFs进行回收、测序,共获得75条有效序列,其中上调表达39条,下调表达21条,瞬时表达15条。BLAST结果分析显示其中55条与已知功能基因具有较高的同源性,选取其中10条TDFs,以甜瓜Actin基因为内参照,对其在不同胁迫处理时间的表达情况进行半定量RT-PCR验证,分析结果与cDNA-AFLP结果基本吻合,表明cDNA-AFLP技术是研究甜瓜化感自毒作用相关基因差异表达的有效方法。55条TDFs的BLAST结果显示,甜瓜自毒作用涉及到的基因表达情况较为复杂,与信号转导、能量代谢、蛋白合成、离子运输、逆境响应和转录调控等过程均有关系,这一结果为探讨甜瓜化感自毒作用的分子机理和相关基因的克隆提供了理论依据。     

实时定量PCR检测转基因水稻科丰6号插入拷贝数和转基因含量

建立转基因成分灵敏、准确的定量标识是实施转基因安全阈值管理的一个基本步骤,其中实时定量PCR技术是检测产品中转基因含量的主要技术方法。本研究利用该技术确定了双价(cry1Ac+CpTi)转基因抗虫水稻(Oryzasativa)科丰6号中有3个拷贝的外源基因插入。通过对外源基因Bt和转化事件特异的边界特异序列为对象的绝对定量和相对定量检测方法的研究,发现以边界特异序列为对象的事件特异性检测和以目的基因Bt为对象的检测都能够满足相对定量检测的要求。在100ng基因组DNA中,Bt基因和特异性检测的相对定量检测限分别为0.1%和0.5%,在绝对定量检测中,特异性检测的检测限为5个拷贝。不同检测方法对4个已知转基因含量的样品检测结果与预期均一致。结果表明,以转基因产品占总产品比例为定义的转基因含量的测定中,多拷贝或单拷贝基因为对象的不同定量方法的检测对转基因产品的相对定量结果没有影响,本研究对转基因产品的定量阈值设定具有一定的借鉴意义。     

甘蔗R2R3-MYB类似基因Sc2RMyb1的克隆及表达特性分析

R2R3-MYB是MYB转录因子基因家族的主要成员,已被证明在次生代谢和非生物逆境胁迫应答中起重要作用。为获得甘蔗(Saccharum complex)R2R3-MYB转录因子基因序列信息及其在不同非生物因子胁迫下的表达情况,本研究通过对甘蔗EST数据的分析,运用电子克隆获得一个甘蔗R2R3-MYB类似基因序列,进而采用PCR方法从甘蔗中克隆了该基因的基因组DNA和cDNA序列,基因命名为Sc2RMyb1(GenBank序列号:JQ823165)。Sc2RMyb1的基因组DNA全长1807bp,由3个外显子和2个内含子构成,编码区长度为1284bp,编码427个氨基酸。构建含有Sc2RMyb1基因的原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli),经IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52kD。在NaCl胁迫的LB培养基上,重组菌生长明显优于对照菌。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中Sc2RMyb1基因的表达受H2O2和NaCl抑制而下调,推测该基因作为负调节因子参与了NaCl胁迫应答相关基因的调控过程。本研究结果为后续该类转录因子基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用提供了基础资料。     

亚洲棉中与棕色素合成相关基因GaTT12a的克隆及表达特征

棕色棉具有典型的自然棕色纤维,在纺织及加工过程中无需漂染,是真正的“生态”、“环保”棉.克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因对于揭示棉花纤维色素发育的分子机理具有重要的意义.本研究选取亚洲棉(Gossypium arboreum)棕色纤维慈溪紫棉和白棉余姚中棉纤维发育不同阶段RNA,采用Gene Fishing技术,获得1条仅在亚洲棉棕色棉纤维中特异表达的约500bp的PCR扩增产物,根据测序结果和生物信息学分析发现,该基因在核苷酸序列上与拟南芥(Arab idopsis thaliana)种皮棕色素合成TT12基因存在76％的序列同源性.随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因,命名为GaTT12a(GenBank登录号:JX013908),该基因编码490个氨基酸残基,分子量约52.7 kD,属于MATE超基因家族中的一个成员.利用荧光定量PCR分析了GaTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮的表达特征,结果表明,GaTT12a基因在棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达,在白色棉纤维中几乎不表达,说明该基因参与纤维棕色素的形成,结果暗示棉花种皮棕色素和纤维棕色素可能分享相似的合成代谢途径.研究结果为进一步了解GaTT12a基因参与棕色棉纤维色素形成、棕色棉纤维色素与种皮棕色素合成之间的关系提供了基础研究资料.