猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为快速、准确、灵敏检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,以PEDV N基因为靶标设计引物,建立了一种PEDV SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法最低可以检测到10个拷贝的病毒核酸,与猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒等胃肠道病毒均无交叉反应,批内、批间重复试验的变异系数均在2%以内,表明该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。运用该方法对2018—2019年采集自山东省不同地区猪场的161份临床样品进行检测,检测结果与RT-PCR方法完全一致。以上结果说明,本试验所建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法为PEDV的快速检测提供了良好工具和技术支持。     

高温胁迫下水稻胚乳淀粉分支酶各同工型基因的表达特征

 以稻米品质温度敏感型的早籼稻品种浙辐49为材料,利用人工气候箱控温处理试验和实时荧光定量PCR技术,探讨了水稻发育胚乳中淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)的3种主要同工型基因 (SBEⅠ、 SBEⅢ和SBEⅣ) 在不同温度处理下的相对表达量差异及动态变化特征。结果表明,高温处理对水稻胚乳中SBE基因的表达调控因其同工型的种类而异,SBEⅣ基因在高温处理下呈上调表达,而SBEⅠ和SBEⅢ基因在高温处理下的相对表达量则明显降低,表现为下调表达;与SBEⅣ等同工型相比,水稻胚乳中SBEⅠ基因对高温胁迫的表达响应相对更敏感。     

富含多糖甜玉米幼穗RNA提取及高温胁迫基因表达分析

以改良Trizol试剂法从富含多糖的甜玉米幼穗中提取高质量、完整的总RNA,利用实时荧光定量PCR对高温胁迫下粤甜13雌穗发育的8个差异表达基因进行分析。结果表明,8个基因分为上调表达和下调表达,实时荧光定量PCR和测序法基因表达谱检测的基因上调或下调表达的趋势一致,上调表达基因ZM2G058057和下调表达基因ZM2G059964、ZM2G044670相对表达量较高,可能在高温胁迫影响甜玉米幼雌穗发育过程中起更重要的作用。     

TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国重要的检疫性有害生物,BPMV传入的风险随大豆进境数量增多而加大。本文针对菜豆荚斑驳病毒,以大豆种子提取液为材料,分别建立了TaqMan-MGB荧光定量IC-RTPCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR快速检测方法。根据GenBank公布的BPMV外壳蛋白基因序列,选择其保守区域,设计1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,测定了TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR方法的特异性和灵敏度,并将TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR、TaqMan-MGB荧光定量TC-RTPCR、IC-RT-PCR和TC-RT-PCR 4种检测方法的灵敏度进行比较。结果表明:所建立的两种检测方法特异性良好;TCRT-PCR的灵敏度为10-1倍病毒提取液原液;IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR灵敏度相当,为10-3倍病毒提取液原液;TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR灵敏度最高,为10-5倍病毒提取液原液,是IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR检测方法的102倍,是TC-RT-PCR检测方法的104倍;两种检测方法均能较好应用于实际大豆样品的检测。本文所建立的TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测方法利用抗原特异性或试管非特异性捕捉病毒粒子,无需提取RNA,为进境大豆种子上BPMV的检测提供了稳定、快速、简便的技术依据,其较高的灵敏度和特异性具有较好的应用价值。     

小麦籽粒淀粉合成酶基因表达与酶活性特征的研究

为研究小麦籽粒淀粉合成酶基因表达与酶活性的特征,以普通小麦品种秦麦11(粒重36.942 mg/粒,淀粉含量61.02%)和中优9507(粒重50.636 mg/粒,淀粉含量68.36%)为材料,采用实时荧光定量RT-PCR方法,对灌浆期籽粒淀粉合成酶相关基因的表达进行了研究,并对其表达量与相应酶活性的相关性做了分析.结果表明,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(AGPase)、束缚态淀粉合成酶基因(GBSSI)、可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、淀粉分支酶基因(SBE)表达均呈单峰曲线变化,在花后3 d 内检测不到其表达,花后4～6 d 这些基因开始表达.AGPase和SSS在花后12 d左右表达量达到高峰,GBSSI和SBE在花后15 d左右的表达量最大.自花后18 d开始,各基因的表达量均显著下降.中优9507在表达高峰期(即花后第12、15、18 d)的酶基因相对表达量均显著高于秦麦11,且差异均达显著水平.整个灌浆期间中优9507的四种淀粉合成酶活性高于秦麦11,尤其在灌浆中期差异更显著.相关分析表明,AGPase、SSS、SBE基因在花后15 d的相对表达量与相应酶活性间呈极显著正相关,而GBSS基因的相对表达量与GBSS酶活性间相关不显著,暗示AGPase、SSS、SBE基因在籽粒淀粉合成过程中属于转录水平调控,而GBSSI基因属于转录后调控.     

玉米中RING型E3泛素连接酶基因ZmGW2的表达分析

前期研究克隆得到ZmGW2基因, 该基因与水稻粒重相关基因OsGW2同源, 编码一个RING型E3泛素连接酶。研究表明, 该基因位于玉米的百粒重相关的QTL区域, 并且其表达量与玉米粒宽呈显著负相关。通过荧光定量PCR研究分析ZmGW2在杂交优势系中的表达量, 结果验证该基因的表达与玉米粒重呈负相关。半定量RT-PCR分析该基因在逆境胁迫下的表达模式, 结果表明, ZmGW2基因还可以被高盐(NaCl)、干旱、低温(4℃)和脱落酸(ABA)等逆境胁迫诱导表达。     

苦瓜果实S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因McSAMDC的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与SAMDC基因相关的EST序列,采用3′RACE技术,克隆获得1个苦瓜SAMDC基因的cDNA全长序列,命名为McSAMDC(GenBank登录号为KC632099).生物信息分析结果表明,该cDNA全长l900bp,5′UTR和3′UTR分别长501、325bp.该cDNA序列存在3个开放读码框(微型tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),其中mORF长1077bp,编码358个氨基酸,预测分子量为39.31ku,含有酶原剪切位点结构域和蛋白快速降解有关的PEST二个保守结构域.二级结构分析显示,McSAMDC含有无规卷曲(45.53％)、α-螺旋(29.33％)、伸展链(19.83％)、β-转角(5.31％).序列分析结果表明,McSAMDC与拟南芥(CAA69073.1)、琴叶拟南芥(XP002882231.1)和雪里红(AAS45435.1)的氨基酸序列相似性分别达到69％、68％和68％.亚细胞定位结果表明,McSAMDC定位在细胞质中.荧光定量结果表明,McSAMDC在果实膨大期表达量最高,并随之迅速下降,并从成熟初期至完全成熟期该基因表达量逐渐增大.     

马银花愈伤组织RoWUS基因及其启动子的克隆与表达分析

WUSCHEL(WUS)基因是植物干细胞的标志基因。采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到Ro WUS c DNA全长序列,采用染色体步移法克隆得到该基因的启动子序列,登录号分别为KF365488、KF861578。马银花Ro WUS c DNA全长1 123 bp,编码302个氨基酸;DNA序列2 001 bp,包含2个内含子和3个外显子;启动子序列3 122 bp。生物信息学分析表明:Ro WUS亚细胞定位于细胞核,是不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有跨膜结构,包含homeodomain功能位点。系统进化树分析结果表明:Ro WUS单独形成一个分支,与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系最近。对Ro WUS的启动子进行分析表明,该启动子除了含有丰富的TATA-box和CAAT-box等基本元件以外,还含有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件和其他功能元件。q PCR结果表明:Ro WUS基因在马银花愈伤组织不同生长时期中呈先上升后下降的趋势,在第5个继代周期时表达量最高。外源赤霉素和脱落酸浓度为15 mg/L时表达量最高,说明Ro WUS基因在该浓度时对赤霉素和脱落酸的响应最强。     

育珠对合浦珠母贝N19和Prismalin-14基因表达水平的影响

为探讨育珠对壳基质蛋白基因表达的影响,开展了合浦珠母贝（Pinctada fucata）N19和Prismalin-14基因在育珠贝和非育珠贝中的荧光定量表达研究。结果显示,N19和Prismalin-14在育珠贝与非育珠贝的闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中均无表达,在外套膜均有表达;N19在珍珠囊表达,而Prismalin-14则不表达。N19勺Prismalin．14在育珠贝外套膜的表达量均大于非育珠贝,表明育珠可能对某些壳基质蛋白的表达具有一定的促进作用。其中Prismalin-14在育珠贝外套膜的表达量最高（P〈0．01）,是非育珠贝外套膜Prismalin-14的1．23倍,是育珠贝外套膜N19的25．04倍,是非育珠贝外套膜N19的41．04倍,推测在珍珠贝生长过程中,对Prismalil7-14的需求量可能比N19大。N19在育珠贝珍珠囊中表达量最高（P〈0．01）,是育珠贝N19外套膜的11．58倍,是非育珠贝外套膜的18．97倍,推测在珍珠形成的过程中,对N19的需求量可能比贝壳自身生长对N19的需求量大。     

高丝氨酸内酯酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒斑马鱼保护效应的研究

为评价斑马鱼口服高丝氨酸内脂酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒的保护效应,实验设置基础料与实验料两组饲料,实验料是在基础料中按3 U/g饲料添加N酰基高丝氨酸内酯酶AI-96(以下简称AI-96),通过高浓度(2.5×108 cfu/mL)及低浓度(0.7×108 cfu/mL)两组剂量的嗜水气单胞菌NJ-1(以下简称NJ-1)分别浸浴攻毒斑马鱼,在12h、24 h、3d、7d和14d取鳃丝、肠道壁、肝和肾样,采用实时荧光定量PCR法检测取样器官中NJ-1量,并统计攻毒周期内的死亡率,来评价高丝氨酸内酯酶AI-96的保护力.结果显示:在攻毒周期内所取组织内均检测到NJ-1,按菌数肠＞鳃＞肝＞肾,其中高NJ-1剂量未加酶组各组织NJ-1数量均分别明显高于低剂量处理组.在高剂量攻毒条件下,加酶组各组织NJ-1数量均显著低于未加酶处理组(P＜0.05),鳃除外;在低剂量攻毒条件下,未加酶组的NJ-1数量在鳃(3 d)、肠(0.5、1、3、7及14 d)、肝(3 d)和肾(7 d)显著高于加酶组(P＜0.05),其余差异不显著(P＞0.05).此外无论在高、低剂量攻毒条件下,加酶组的死亡率均低于未加酶组,其中低剂量攻毒7d及以后其死亡率显著低于对照(P＜0.05).结果表明,口服AI-96可以有效预防NJ-1≤0.7×108 cfu/mL范围内的侵袭.