藏系绵羊IGF-1基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR SYBR GreenI荧光染料法,对藏系绵羊皮肤细胞中IGF-1基因的表达水平进行了相对定量分析,建立了快速检测IGF-1基因表达量的方法。通过该方法检测出了IGF基因在藏系绵羊皮肤细胞中的相对表达量,且表达量有差异。该方法具有灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点。     

环介导等温扩增基因诊断技术及其在动物病毒病诊断中的应用

基因扩增诊断技术是分子生物学领域中的一项重要研究手段,人们已经建立了多种方法,其中PCR技术是众多方法中最为常用的一种,但是PCR在实际应用中存在许多不足之处:(1)目标靶基因容易被污染;(2)常引起非特异性扩增;(3)多种因素可以产生抑制扩增反应;(4)需要比较昂贵的PCR仪;(5)扩增反应时间较长,一般需要几个小时,不利于在基层实验室推广应用.     

RHIGF-Ⅰ对体外单层培养的肝细胞PEPCK mRNA 丰度的影响

根据牛肝细胞中持家基因表达的恒定性,选用β肌动蛋白（β-actin）作为内参照,检测外源性添加不同质量浓度的重组人胰岛素样生长因子（RHIGF-Ⅰ）对体外培养牛肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA表达水平的变化情况。选用体外培养的犊牛单层肝细胞为实验模型,当细胞贴壁后在无血清培养液中添加RHIGF-Ⅰ,其终质量浓度分别为0、5、10、15、20、30、40、50、60、100、150μg/L,待添加8h后,提取总RNA,反转录,用相同的模板扩增PEPCK基因及β内参,再比较各梯度目的基因与内参的灰度。结果表明,随着添加RHIGF-Ⅰ质量浓度的升高,PEPCK mRNA表达呈下降趋势,且均低于对照组。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒（CaPV）末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法。结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性。与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性。表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测。     

鹅生长激素受体基因克隆及其个体发育性表达研究

以籽鹅为实验材料,根据鸡生长激素受体(GHR)基因mRNA序列设计并合成引物,通过PCR技术克隆了鹅GHR基因,并利用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测籽鹅出壳到90日龄GHRmRNA在部分组织中的表达量变化。结果表明:鹅与鸡和鸭的GHR基因核苷酸序列同源性为97.1%和99.1%,氨基酸同源性均为99.1%。籽鹅肝组织中GHRmRNA表达水平在10到90日龄都较高,显著高于1日龄,以30日龄的表达量最高。30日龄GHRmRNA在肝脏等检测的组织中都有表达,但在肝脏和骨骼肌中的表达量高。肝组织中GHRmRNA表达量与日增重呈显著正相关(r=0.9116)。本实验结果揭示了生长期籽鹅组织中GHRmRNA表达水平的差异,为进一步研究生长轴相关基因对鹅生长及繁殖的调控作用奠定基础。     

实时荧光定量PCR对瘤胃纤维分解菌定量方法的构建

试验构建了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌等3种瘤胃纤维分解菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线,以用于纤维分解菌的定量测定。提取瘤胃微生物总DNA,以各菌特异性引物进行PCR扩增,回收纯化PCR产物,与pMD18-T Vector连接并转化到大肠杆菌。用氨苄青霉素培养基筛选阳性重组质粒,提取含目的片段质粒DNA,通过PCR及测序鉴定重组质粒。根据OD值确定浓度,将梯度稀释的质粒作为模板,进行荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果表明:所构建的3条标准曲线具有很高的相关性(R2>0.999),并获得了高扩增效率产物(白色瘤胃球菌为101%、黄色瘤胃球菌为98.0%、产琥珀酸丝状杆菌为97.7%),说明成功构建了瘤胃纤维分解菌实时绝对定量PCR的标准品和标准曲线,为定量研究瘤胃纤维分解菌奠定基础。     

采用RT-PCR方法诊断猪繁殖与呼吸综合征

山东某猪场发生以猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)为主要特征的疾病。笔者对送检的病料进行了实验室诊断:剖检主要发现肺水肿,出血;组织病理学检测主要发现肺间质明显增宽,肾小管上皮肿胀;采用RT-PCR检测方法检测猪肺脏组织,结果被验样品在400bp扩增带为PRRSV阳性,阴性对照无扩增带出现。诊断结果表明:该猪场发生的病例为猪繁殖呼吸障碍综合征。     

多浪羊双肌臀基因Callipyge序列分析

绵羊的双肌臀(Callipyge)基因表现型为后臀肌肉增大近30%,由位于绵羊第18号常染色体上基因上游存在一个N→C的单核苷酸多态性(SNP)标记(命名为SNPCLPG)产生的,该SNP标记的存在与Callipyge表现完全吻合。为此,根据已知多态性,选择设计合成了1对引物,以多浪羊为研究对象,对PCR扩增产物直接测序,进行了SNPCLPG位点的检测。获得303bp的扩增片断,测序后进行序列分析,发现在38bp处碱基产生A到G的突变,在80、92、149、219bp处碱基产生T到C的突变。     

猪德尔塔冠状病毒纳米PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)毒株M基因设计特异性引物,建立了PDCo V纳米PCR检测方法并进行了临床样品检测。结果显示:该方法对标准品检测的最低浓度可达102 copies/μL,与其他几种常见猪病病毒无交叉反应;用该方法检测国内猪场62份腹泻粪便样品,相比常规PCR方法,该纳米PCR方法的检出率更高,而两种方法对268份进境活猪粪拭子样品检测均为阴性。结果表明,本研究所建立的纳米PCR检测方法适用于国内猪场的PDCo V检测和进境活猪的监控检测,可作为PDCo V实验室检测的有力技术手段。