兔源强毒力金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH₂O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1 000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。     

黄瓜DNA提取及优化SSR反应体系的建立

本文简化了黄瓜DNA提取程序并探讨了黄瓜SSR反应程序及体系.反应体系25 μL:10×buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L MgCl2 2.0 μL,2 mmol/L dNTP 2.5 μL,gDNA模板(10 ng/μL)2 μL,forward primer(10 pmol/μL)0.5 μL,reverse primer(10 pmol/μL)0.5 μL,ddH2O 14 μL,Taq DNA聚合酶(1 U/μL)1 μL.反应程序:95℃预变性5 min,94℃变性30 sec,49℃退火1 min,72℃延伸90 sec,循环次数35,72℃延伸5 min.     

贵州省薯类脱毒种苗快繁中心简介

贵州省薯类脱毒种苗快繁中心是农业部发展脱毒马铃薯生产区域布局的重点基本建设项目，共计完成投资800余万元，并于2007年9月通过验收。中心拥有12480m^2温室大棚，其中智能温室960m^2，连栋大棚11520m^2，500m^2常温库和377．3m^3冷库，2000m^2试验大楼，500m^2组培室，以及完备的组培设备。此外中心还拥有酶联及PCR检测的病毒检测分子实验室。中心具有年产马铃薯试管苗350万株，马铃薯原原种1000万粒的能力。[第一段]     

萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因PCR定点突变及其在大肠杆菌中的表达

根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因序列，结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性，人工合成引物，利用PCR重叠延伸法，使编码序列区的部分核苷酸突变，采用嵌套PCR，迅速克隆到目的基因片段R -AFP,连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌XL1菌株，筛选到阳性克隆。序列分析结果表明，PCR产物全长240bp，有一个阅读框，编码29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白，与突变前的Rs-AFP2基因相比，在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基（TTG→TTA)，第5号氨基酸Gln相差一个碱基（CAG→CAA），第6号稀有密切Arg相差两个碱基（CAG→CGA），但二者编码产生相同。重新合成引物，将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因分别克隆到pET-21b( )质粒载体上，导入大肠杆菌BL21菌株。Tricine-SDS-PAGE电泳显示工程菌中存在6KD左右的目的蛋白带；软件分析显示，突变后pETAFPm的表达产物约为突变前pETAFPo表达产物的2倍；抑菌结果表明，pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比，已有效的提高表达量。     

西瓜种子进行细菌性果斑病检测的研究

细菌性果斑病(Acidovorax citrulli)是一种由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. Citrulli)引起的严重危害葫芦科作物的世界性病害,该病主要通过种子远距离传播,如果能够在种植瓜果之前就检测出种子是否带病,就能有效防止果斑病及其他更多的病菌对果农造成经济损失。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和PCR检测法对5份西瓜种子进行细菌性果斑病检测,旨在对两种不同的检测方法进行比较并探究各自的优劣。经过实验对比两种方法发现,ELISA检测方法实验结果容易受外界影响,对操作要求比较高,且精度不如PCR检测法,但在PCR检测法中引物选择十分重要,引物选择直接关系到实验的准确性,因此对PCR检测细菌性果斑病引物选择方面的探索还要继续进行。     

狂犬病套式PCR检测技术的研究

设计两对引物M1/M2、N1/N2建立起套式PCR,该方法能检测出含0.3LD50狂犬病病毒,比普通PCR的敏感性提高了10000倍,通过27份阳性病料的序列分析,所检测出的病毒全部是狂犬病病毒,具有很强的特异性。表明套式PCR技术具有快速、敏感、特异的特点,可广泛应用于实验室狂犬病的诊断及流行病学调查。     

检测柑橘黄龙病的四对常规PCR引物特异性和灵敏度比较

柑橘黄龙病是目前危害柑橘产业的重要危险性病害,实验室中通过PCR技术检测柑橘黄龙病是最有效的方法,因此,确定一组特异性好、灵敏度高的引物至关重要。本文通过荧光定量PCR标定柑橘黄龙病菌核酸浓度的方法,对目前各实验室常规PCR应用比较广泛的4对引物（P400F/R、P535F/R、OI1/OI2,16SF/R）做了特异性和灵敏度的比较。结果发现4对引物均能排除其它来源核酸的干扰,表现出明显的特异性,但在灵敏度方面4对引物差别很大,灵敏度结果是依次为：16SF/R＞P400F/R ＞P535F/R=OI1/OI2,灵敏度最高的16SF/R引物检测柑橘黄龙病菌核酸含量约为1.87×10﹣2 ng/μl。本研究结果为实验室开展检测柑橘黄龙病研究提供了很好的理论与实践基础     

定量分析柑橘黄龙病菌在沙糖橘中的分布

柑橘黄龙病是由难培养的革兰氏阴性菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”引起的严重为害柑橘的系统性病害。本研究通过实时荧光PCR 检测黄龙病菌在沙糖橘上的分布情况,结果表明不同部位黄龙病病菌浓度存在较大差异。其中果实中橘络部位病菌含量最高,且病原菌在果实中呈现富集的状态。本研究结果可为病原菌在植株体内的转运规律提供参考。     

风湿祛痛胶囊中地龙药材的鉴定

目的地龙是巨蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。具有清热定惊,通络,平喘,利尿的功效。近年来,由于需求量大,出现地龙掺假的现象,于是采用分子生物学方法来鉴定地龙的真伪,同时建立一种鉴定地龙的方法。方法提取地龙粉末、地龙水提物、地龙醇提物、风湿祛痛胶囊的DNA,采用PCR方法得到PCR产物,并电泳鉴定其产物大小,鉴定地龙真伪,通过实验验证方法的稳定性。结果研究发现含有地龙的制剂的PCR产物均在260bp之间有单一条带,并摸索得出鉴定的条件为:95℃预变性5 min,35个循环(95℃变性30 s,58℃30 s,72℃30 s),72℃延伸5 min,经过验证具有稳定性。