一定免疫程序下猪瘟、猪伪狂犬病抗体水平合格率分析

猪瘟、猪伪狂犬病一直危害着我国的养猪业，为提高猪群对这两病的抵抗力，减少经济损失，浙江加华种猪有限公司通过抗体水平检测及合格率分析，确定了本场猪瘟、猪伪狂犬病科学、合理的免疫接种程序。     

狂犬病病毒SRV9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析

根据已发表的狂犬病病毒核蛋白基因序列，设计并合成了一对引物，从SAD株驯化的SRV9。蚀斑株中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增出核蛋白的全长cDNA序列，测序结果显示，其序列与国外报道的SAD母源株序列一致。将核蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28b( )中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，于30℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达，大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE分析，在分子量约为56kDa处出现一新的蛋白带。和预期的目的蛋白分子量相符，Western-blotting检测表明，表达产物能与狂犬病病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，扫描分析显示，表达产物占菌体总蛋白的23%，包涵体分离，纯化后，纯度达89%，上述结果为核蛋白在狂犬病基因免疫和免疫检测中的进一步应用奠定了基础。     

伪狂犬病病毒gB蛋白抗原表位基因串联构建及原核表达

本试验通过自行设计两段引物,利用重叠延伸PCR方法,将伪狂犬病病毒(PRV)gB基因两段优势抗原表位序列串联,克隆至pMD18-T载体,测序正确后双酶切连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒;重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白表达情况。经检测,诱导后的重组蛋白获得表达,重组蛋白大小约为54ku,其中串联蛋白大小约为34ku。该重组蛋白可与伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体发生特异性反应,表明重组蛋白的抗原性良好。     

狂犬病病毒糖蛋白转基因小鼠的构建研究

将狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ ＢｇｌⅡ（１．６７ｋｂ）片段正向插入ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋ＢａｍＨⅠ切点，构建重组质粒ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋－Ｒｇｐ，用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ对ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋－Ｒｇｐ进行双酶切后，回收含有狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ和绵羊ＭＴ启动子的２．７６ｋｂ片段，通过显微注射技术将该片段注入小鼠单细胞受精卵雄前核内，在进行胚胎移植后，获得４４只小鼠，经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及原位     

伪狂犬病病毒鄂A株gG^—／LacZ^＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphI/KpnI片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待细胞完全病变后，在X－gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG^-/LacZ^ 的重组伪狂犬病病毒。     

乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建

设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。     

广西家犬狂犬病病毒的感染状况调查

为了解广西家犬狂犬病病毒的感染状况，采用RT—PCR方法对广西13个市、地区的家犬携带狂犬病病毒情况进行了检测，结果阳性检出率达6．69％(19／284)，证明广西家犬存在一定程度的带毒。     

猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型三重PCR快速诊断试剂盒的研制与应用

为了快速、灵敏、准确的鉴定猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvoviurs,PPV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2),从而为猪病的预防以及诊断提供依据,根据GenBank上发表的核苷酸序列分别设计了三对能特异性扩增PRV、PPV、PCV2的引物,并成功构建了重组质粒作为阳性对照,经过条件优化后建立了检测PRV、PPV、PCV2的三重PCR检测方法,对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保质期进行研究,并进行了初步的临床验证.试验证明,该检测试剂盒能同时扩增出猪伪狂犬病毒219bp的核苷酸片段,猪圆环病毒2型410bp的核苷酸片段以及猪细小病毒71 1bp的核苷酸片段,并通过在PCR缓冲液中添加5％的DMSO和1M的甜菜碱,减少了非特异性扩增,提高了检测试剂盒的灵敏度.该诊断试剂盒为流行病学的研究以及疾病的诊断提供了简单快速的选择.     

伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

规模化猪场猪伪狂犬病的净化

为了弄清现有防疫体系下鸿达物业有限公司猪场(以下简称本场)对猪伪狂犬病的净化情况,2008年7月～2009年7月,共采集不同类别猪群的血样2410份送检。结果显示:本场生产种猪野毒抗体阳性率从25.6%下降到0.4%,后备猪野毒抗体阳性率从12.3%下降到0.1%,仔猪和保育猪野毒抗体阳性率从8.9%下降到0.1%。生产种猪、后备猪、仔猪和保育猪的伪狂犬病野毒抗体阳性率呈逐年下降趋势,取得明显的净化效果,获得了较大的经济效益。