嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93．1％-95％之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot,在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学,2008,15（2）：301—306]     

菜豆种子几丁质酶的分离纯化及性质研究

运用硫酸铵分级沉淀与亲和层析技术相结合的方法,分离纯化了菜豆种子中的几丁质酶。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电脉图谱显示,经亲和层析后的蛋白质样品呈单一谱带,分子质量为３．４６×１０＾４,纯化倍数达４８．８倍,几丁质酶回收率为４７％,酶的最适温度为４５℃,最适ｐＨ值为６．０。纯化菜豆种子几丁质酶对绿色木霉菌生长具有抑制作用。     

牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

运用Sephacryl S-200凝胶层析和HiTrap rProtein ASepharose亲和层析2种方法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清免疫球蛋白进行分离纯化,结果表明,牙鲆免疫球蛋白分布于33%~50%的硫酸铵饱和溶液中,其中45%的分离效果最好。凝胶层析和亲和层析样品均出现2个蛋白峰,用还原SDS-PAGE检测确定牙鲆免疫球蛋白存在于第2个蛋白峰中。牙鲆免疫球蛋白重链分子量约为75.4 kD,轻链分子量约为29.9 kD和28.2 kD,推测牙鲆血清免疫球蛋白的分子量为836 kD。制备了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体,免疫双扩散法检测多克隆抗体效价为1∶32,免疫斑点法检测多克隆抗体效价至少为1∶1 600。运用免疫印迹法(Western-bloting)检测了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体的特异性,实验证明该抗体与牙鲆全血清中免疫球蛋白重链、轻链反应均成阳性。     

融合蛋白C3d提高新城疫灭活苗的免疫原性

补体C3d是补体系统（complement system,CS）中补体c3的最终裂解产物。本试验利用RT—PCR技术从从肉鸡肝脏总RNA中扩增C3dcDNA,测序证实为C3d基因。然后将其连接至表达载体pET-32a（＋）,转化E．coliBL21（DE3）,1％IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blotting证实目的蛋白为C3d。亲和层析分离C3d融合蛋白,与纯化新城疫病毒（Lasota株）经戊二醛连接后免疫SPF鸡。血凝抑制试验（HI）检测新城疫抗体水平,MTT法检测胸腺T淋巴细胞转化率。结果表明C3d融合蛋白能够提高特异性抗体水平以及细胞免疫水平,本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d奠定了基础。     

表达MERS-CoVS1蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-MERS_(S1)纯化方法的建立

建立一种可线性放大、应用于表达中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)S1蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-MERS_(S1)的规模化纯化方法。将收获的病毒去除细胞碎片、灭活后,分别通过3种方法(醋酸锌沉淀+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 000中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 000中空纤维超滤柱+Cellufine~(TM )Sulfate亲和层析)进行纯化,经比较筛选出一种温和、目的蛋白回收率高、纯度高的纯化方法。结果显示,500 000中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析回收的抗原含量最高,50 mL重组病毒原液经纯化后可得到1.82 mg蛋白,杂蛋白去除率达到97.02%,病毒纯度较高,电镜下可见到病毒囊膜刺突。结合成本等方面综合考虑,此方法优于其他2种纯化方法。本试验筛选获得了一种适用于rSRV9-MERS_(S1)的纯化方法,为rSRV9-MERS_(S1)规模化纯化工艺的建立与MERS新型疫苗的研制奠定了基础。     

从新旧蚯蚓匀浆液中制备蚯蚓纤溶酶组分的比较研究

为探寻从蚯蚓匀浆液中制备蚯蚓纤溶酶(EFE)的简便途径,利用亲和层析的方法,分别从新鲜制备的与多年存放的蚯蚓匀浆液中制备了新、旧蚯蚓纤溶酶(即新、旧EFE)。利用天然电泳、SDS-PAGE纤维蛋白活性电泳分析组分差异,通过纤维蛋白平板比较两者纤溶酶活性,发现蚯蚓匀浆液在存放过程中,EFE的部分组分发生降解,但EFE的比活却升高了1.4倍。     

免疫亲和层析法分离鸡补体C3d蛋白研究

利用抗鸡C3 21肽抗体制备免疫亲和层析柱,对鸡补体C3d进行了分离,并采用间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA),对洗脱液中的C3d组分进行了检测,以SDS-PAGE电泳方法对分离到的C3d进行了检测。结果表明,利用亲和柱层析能够分离得到纯度较高的C3d蛋白,为鸡血清中C3d的提取纯化提供了较为简便的方法。     

牛精子膜麦芽凝集素结合糖蛋白的分离与定位

牛精子膜用非离子去污剂 NP-40增溶,经固相凝集素亲和层析,初步分离了精子膜麦芽凝集素结合糖蛋白,经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染色显示出了四条蛋白质带,分子量分别为78,60.42和33 kD。用分离到的糖蛋白制备抗血清,对牛精子进行免疫细胞化学标记,结果顶体区显示为强阳性,与麦芽凝集素亲和细胞化学的染色一致。用抗血清处理精子再进行亲和细胞化学染色时,顶体区的麦芽凝集素结合糖残基多数被封闭,揭示麦芽凝集素结合糖残基是构成抗原决定簇的成分。     

改性与修饰壳聚糖亲和层析纯化抑肽酶

为了解决抑肽酶制备过程中的高污染、高成本、吸附剂使用条件苛刻等问题,本试验采用化学改性与修饰壳聚糖为载体,共价法偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,将其直接亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶。抑肽酶抑制比活单位(BAEE/mg)为3 936.46,酶活性回收率70.81%,最后的纯化倍数达到114.37倍。