建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建

取含有卡那霉素抗性（Kan^R)基因的自杀性质粒pJP55603和含vpr全长基因的pUC19phiΦRID质粒，分别采用粘性末端及平末端两种连接法，2种质粒Hinc II单酶切后进行平末端连接，经鉴定未得到重组质粒，pJP5603用Hinc II和Xma I消化，回收3kb的载体质粒，pUC19ΦRID用Hinc Ⅱ和Age I消化，回收778bp vpr目的基因，通过粘性末端连接，转化到感受态细菌CC118λpir，利用Kan^R进行筛选，获得的克隆经Acc I酶切鉴定和PCR检测，确定得到重质粒，即pYYvpr，将重组质粒的DNA转化到含有全长vpr基因的感受态细胞MC1061，筛选到的克隆经PCR检测，得到一株克隆既扩增出vpr基因，又扩增出Kan^R基因，初步鉴定该克隆为MC1061的vpr同源基因突变株，暂定名为MC1061Δvpr，从而为研究vpr基因的功能提供了重要的试验材料。     

细菌性条斑病菌JH01诱导水稻抗病均一化差减文库的构建

[目的]构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减c DNA文库,对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。[方法]以水稻IR26(Tester)和两优培九(Driver)幼苗5~6叶期叶片为材料,采用双链特异性核酸酶(DSN)介导的均一化消减杂交技术,构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减c DNA文库,以p LB-F和p LB-R为引物,通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果]c DNA文库的插入片段分布在0.5~2.0 kb,平均大小约为1.0 kb,重组率达95%。序列测定分析发现,随机挑取的504个克隆中有98条差异表达基因;经BLAST比对和GO注释发现,59条序列具有同源基因,分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等;另外39条序列无相似基因,有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现,从该文库中分离得到的Os NDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的c DNA文库质量较好,为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。     

烟粉虱溶菌酶基因的鉴定及表达分析

【目的】鉴定烟粉虱（Bemisia tabaci）体内的溶菌酶基因,并对其序列特征、进化关系和表达模式进行分析,探索该基因在烟粉虱应对球孢白僵菌侵染过程中的作用,为进一步解析烟粉虱先天免疫过程提供理论依据。【方法】以第2代高通量测序的结果为依据,比对非冗余核苷酸数据库,筛选E值＜10^-5的基因为烟粉虱溶菌酶基因（lysozyme gene of Bemisia tabaci,BtLyz）,利用ORF Finder预测BtLyz的开放阅读框,并得到氨基酸序列;利用Pfam和SMART预测BtLyz的蛋白质结构域;利用SinglP 4.1 Server预测BtLyz序列的信号肽;利用MEGA6.0软件进行BtLyz的氨基酸多序列比对;利用MEGA6.0软件,对BtLyz与其他昆虫的31个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用邻接法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析球孢白僵菌侵染烟粉虱卵、若虫、成虫后,在12、24、36、48、60 h时目标基因的时空表达模式。【结果】鉴定出烟粉虱4个溶菌酶基因,分别命名为BtLyz1、BtLyz2、BtLyz3和BtLyz4,基因序列全长分别为1 819、1 149、829和928 nt,分别编码159、160、148和160个氨基酸,且均含有信号肽。蛋白质结构分析、氨基酸序列比对和系统进化分析发现,BtLyz1和BtLyz4属于i型溶菌酶,BtLyz2和BtLyz3属于c型溶菌酶。BtLyz-1与豌豆长管蚜ApLyz-i1位于同一进化支上,BtLyz4与柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆长管蚜ApLyz-i2位于同一进化支上。BtLyz2和BtLyz3与褐飞虱NlLyz-c1和异色瓢虫HaLyz-c3位于同一进化支上。与对照相比,卵期4个溶菌酶基因和若虫期BtLyz4的相对表达量没有显著变化;若虫期BtLyz1的相对表达量先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,24 h时上调表达最明显,为对照组的4.55倍;成虫期BtLyz1和BtLyz4的相对表达量均为先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,60 h时上调表达最明显,为对照组的11.31和4.21倍;若虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调表达,在诱导24 h时上调表达最明显,为对照组的5.09和8.31倍,而后急剧下调,在60 h时下调表达最明显,为对照组的0.19和0.13倍;成虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调的表达趋势,在24 h时上调最明显,为对照组的5.56和8.84倍。【结论】从烟粉虱体内鉴定了4个溶菌酶基因序列,其中2个为c型溶菌酶序列,2个为i型溶菌酶序列;在球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态、不同时间后,卵期的相对表达量与对照相比没有显著变化;在若虫和成虫期,不同BtLyzs表现出不同的表达趋势。4个BtLyzs可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生物防治的潜在新靶标。     

实现识别行间苗草的机器视觉系统设计

在耕作试验室的试验环境之下,开发并测试了能够识别行间苗草作物的机器视觉系统,硬件系统主要由速度可控制的土槽试验车装备、固定在可升降平台上可实时采集图像的imagesoure工业摄像头和作为控制台的工控计算机组成;机器视觉系统根据植物和背景的颜色特征二值化图像与田间作物的位置特征识别苗草。结果表明,采集并处理一副大小为640×480像素的彩色图像的平均时间为291 ms,在行驶速度为1.8 km·h-1条件下系统正确识别率达到了95%。     

实时荧光定量PCR检测血液标本中光滑念珠菌方法的建立

目的 探索快速可靠检测血液标本中光滑念珠菌的新方法.方法 采用真菌26S rDNA D1/D2区序列作为引物,单独和同时扩增光滑念珠菌及白色念珠菌与光滑念珠菌混合物,对血液标本进行荧光定量检测.结果 本方法不仅能够稳定的扩增出光滑念珠菌26S rDNA序列,并且能准确区分出混合物中的白色念珠菌与光滑念珠菌.结论 应用26SrDNA D1/D2区序列的荧光定量PCR是快速、敏感和特异的检测光滑念珠菌方法.     

松材线虫两种实用分子检测技术

为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。结果表明：1）运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860b...     

浓缩苹果汁中扩展青霉菌实时PCR快速检测条件的优化

为了研究苹果汁生产中棒曲霉素产生菌的快速检测,利用实时PCR方法快速检测扩展青霉的可能性,对扩增条件进行优化。在polygatacturonase基因引物设计和传统PCR扩增扩展青霉DNA的基础上,研究实时PCR扩增时退火温度、引物浓度以及底物质量浓度对扩增效果的影响,以获得最佳的参数。结果表明,用Lightercy-cler实时PCR扩增扩展青霉DNA的最佳退火温度为61℃,最佳引物浓度为0.20~0.40μmol/L,底物质量浓度对实时PCR扩增的影响较小。在以上参数下,可以获得良好的PCR扩增曲线、产物溶解曲线以及清晰的产物条带。研究获得的快速检测扩展青霉的实时PCR参数,可用于浓缩苹果汁工业化生产中扩展青霉的快速检测,也可作为其他微生物实时PCR检测时的方法学参考。     

豆粕中转基因成分检测方法的研究

从核酸和蛋白质两个角度对转基因豆粕及大豆原料进行了检测方法上的研究。设计并合成引物对转基因豆粕的内源基因lectin、CaMV35S启动子基因、NOS终止子和Cp4-epsps基因进行检测。应用ELISA的方法对不同含量的转基因蛋白及转基因豆粕进行检测,其检测的灵敏度可达到0.25%,但ELISA不适用于加工产品转基因成分的检测。Western杂交检测转基因豆粕及大豆,其检测极限达到0.5%。对于豆粕这样的加工产品,检测蛋白质及核酸两种方法结合使用,可使检测结果更为准确。