REV感染肉种鸡后动态病理学观察与抗原分布及检测

用网状内皮组织增生病病毒(REV)人工接种1日龄肉种鸡,定期剖杀,通过病理组织学观察病变特征及肿瘤的发生发展;用免疫组化、PCR检测抗原与病毒在体内各器官的分布规律;超薄切片观察肿瘸细胞、病毒的形态.结果显示,肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊较早出现明显的肿瘤增生灶,在这些器官内免疫组化阳性信号出现最早,且信号最强,在5周龄时,心肌、腺胃、肺、肾、骨髓等器官才开始出现阳性信号,但呈中度的阳性反应,9周龄后阳性信号开始减弱.肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊、骨髓扩增出REV的LTR基因片段,超薄切片显示病毒多分布在胞浆内和细胞间隙内.研究发现病变明显的组织中,阳性反应较强,肿瘤细胞增生明显,即强阳性反应的组织器官易形成肿瘤转移灶及肿瘤结节,同时,抗原最早出现在这些器官说明其中可能存在REV的靶细胞.虽然阳性信号在腺胃出现较晚,但90%以上的腺胃肿大说明腺胃也是REV的主要侵害器官.     

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。     

基于VP72基因的非洲猪瘟PCR检测方法的建立与应用

基层兽医快速准确诊断非洲猪瘟,可以加强地方兽医部门的疫情防控能力。笔者以非洲猪瘟结构基因VP72部分序列为检测靶基因,设计特异性引物,优化反应条件,建立常规PCR检测方法。笔者应用新建的检测方法,检测了贵州境内采集的5份病料,其中4份阴性,1份阳性,与非洲猪瘟荧光实时定量PCR复检结果一致。结果表明,笔者新建的PCR检测方法特异性好,与其他病原无交叉性,快捷便利。同时也表明,贵州非洲猪瘟疫情暴发压力较大,应加强疫情防范和扑灭工作。     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

从动物毛中提取DNA研究初探

利用蛋白酶Ｋ分解毛发蛋白，并使用酚和氧仿除去蛋白质杂质方法提取毛中ＤＮＡ。结果测量获得的数据和曲线表明：动物脱落毛发以及从保存多年标本获得的毛发均可用来提取到具有一定纯度和数量的ＤＮＡ，完全可以满足聚合酶链式反应（ＰＣＲ）所需。     

牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立

为建立一种牛支原体(Mycoplasma bovis,MB)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速鉴别诊断方法,针对MB的uvr C基因和BVDV的5'端非编码区(5'-UTR)保守基因序列,分别设计两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为二个温度梯度,建立了鉴别MB和BVDV的二重二温式PCR方法。该方法能同时扩增MB和BVDV,扩增产物大小分别为412和170 bp。特异性试验结果显示,该方法对参试的所有毒株只扩增MB和BVDV基因组,对其它牛病原体无扩增;敏感性试验结果显示,该方法最低能同时检测到104拷贝的两种目的核酸;干扰性试验结果显示,该方法能同时检测两个模板不同浓度的组合,试验结果不受模板影响。综上,本研究所建立的二重二温式PCR方法特异、敏感、快速、简便,可应用于MB和BVDV临床鉴别诊断和流行病学调查。     

鹿源狂犬病野毒8202株基因型的研究

为了从基因水平确定鹿源狂犬病野毒8202株与其它狂犬病病毒的进化关系,应用RT-半嵌套式PCR技术,利用3条引物对病毒的核蛋白基因进行扩增、克隆及序列测定,并与已发表的狂犬病病毒株3aG、PV、CVS、HEP-Flury、RC-HL、Nishigahara、SADB19的核蛋白基因进行了比较分析。结果表明,8202株与其它7个病毒株均来源于同一个进化枝,属于基因Ⅰ型。     

实时荧光定量PCR构建朊病相关细胞因子标准品质粒和标准曲线

为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。