利用抗性基因替换的方法将两个拷贝外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组同一位点

本研究提供了一种新的整合多拷贝外源基因表达单元到枯草芽孢杆菌染色体同一位点的方法。以β-淀粉酶表达单元作为应用实例,本方法包括以下步骤：首先,构建含有一个拷贝β-淀粉酶表达单元的整合质粒pMLK83-CTBA,通过同源双交换获得单拷贝β-淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌1A751染色体α-淀粉酶基因位点的菌株1A751[CTBA]Neo＋;然后,利用抗性基因替换质粒pVK71,将新霉素抗性基因替换为状观霉素抗性基因,得到1A751[CTBA]Neo-Spe＋;最后,整合质粒pMLK83-CTBA再以同源单交换方式整合到1A751[CTBA]Neo-Spe＋染色体,通过新霉素抗性和状观霉素抗性筛选出两个拷贝β-淀粉酶基因整合的重组菌1A751[CTBA2]Neo＋Spe＋。结果显示,利用此方法增加β-淀粉酶基因的拷贝数,能够显著和稳定地提高β-淀粉酶的表达量。     

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.     

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701基因的克隆及高温胁迫下的表达分析

为探讨热激蛋白Hsp70基因在高温胁迫下的响应机制及其分子机理,分析Hsp70基因与叶用莴苣耐热性的关系,本研究通过同源克隆及RACE技术,克隆了叶用莴苣热激蛋白Ls Hsp70-3701基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在叶用莴苣热敏品种P-S11和耐热品种G-S59中高温胁迫下的表达差异。该基因c DNA全长为2 191 bp,开放阅读框为1 950 bp,编码649个氨基酸,具有Hsp70家族特有的标签序列,与拟南芥、番茄、小麦等物种的Hsp70同源性达到90%以上。qRT-PCR分析显示,高温胁迫下该基因在2个品种中的表达均上调,在耐热品种中总体表达水平显著高于热敏品种,且在42℃高温下热敏品种P-S11中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制,而耐热品种G-S59中则能长时间保持较高的表达水平。结果表明,Ls Hsp70-3701基因可能与叶用莴苣耐热性相关。本研究为有效解决叶用莴苣高温抽薹问题提供了数据支持。     

猪CD8B表达谱、基因多态性及其与血液免疫性状的关联分析

白细胞分化抗原8(cluster of differentiation 8,CD8)是主要表达在CD8+T细胞表面的共受体和信号转导分子.CD8B基因编码CD8蛋白的β链,在免疫应答中起着潜在的调节作用.为分析CD8B基因在猪(Sus scrofa)不同组织中的表达特征,并探究CD8B基因多态性对血液免疫性状的遗传效应,本研究利用qRT-PCR测定CD8B基因在大白猪7个组织中的表达量,并用PCR产物测序与限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法对382头大白猪、84头长白猪和90头松辽黑猪CD8B基因编码区进行SNPs检测,以及分析CD8B基因突变对大白猪外周血T淋巴细胞亚群和血常规指标的影响.结果表明,CD8B基因在脾脏中的mRNA表达量最高,然后依次是肺脏、胃、肝脏、肾脏、心脏和肌肉.CD8B基因外显子5处检测到1个错义突变(c.602G＞A),在大白猪、长白猪和松辽黑猪群中均存在3种基因型(AA、AG和GG型),且3个猪种都是GG为优势基因型.统计分析显示,CD8B基因多态性与大白猪血液中的CD4+CD8-、CD4 CD8+、CD4 +/CD8+、血红蛋白含量(hemoglobin,HGB)和红细胞压积(hematocrit,HCT)指标显著相关(P＜0.05).最小二乘分析表明,3种CD8B基因型个体具有不同的血液参数,其中GG型的CD4+CD8-指标显著高于AG型,AG型的CD4-CD8+指标显著高于GG和AA型,GG和AA型的CD4+/CD8+、HGB和HCT指标显著高于AG型(P＜0.05).因此,CD8B基因可能参与血液生理指标的调控,可作为影响猪免疫性状的重要功能候选基因.本研究为进一步揭示CD8B基因的生物学功能提供依据,也为猪的标记辅助抗病育种提供了基础资料.     

基因差异表达技术cDNA-SCoT在植物上的研究应用

目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCoT)分子标记是一种源于起始密码子ATG翻译起始位点保守区域来设计其侧翼单引物的标记技术.自从首次应用SCoT标记进行甘蔗(Saccharum officinarum)基因差异表达分析以来,该技术己被广泛应用于花生(Arachis hypogaea)、玉米(Zea mays)、铁皮石斛(Dendrobium officinale)、芒果(Mangifera indica)、西瓜(Citrullus lanatus)等植物的研究.本文介绍了cDNA-SCoT技术的原理、引物设计方法及特征,着重总结cDNA-SCoT技术体系筛选及其在抗病、抗寒、抗旱、遗传进化等方面的应用研究,以期为科研工作者在选择差异表达分析技术提供参考.     

小麦籽粒胚乳淀粉合成酶基因表达及酶活性分析

为研究小麦籽粒淀粉合成酶基因表达与酶活性的特征,选用4个淀粉含量差异较大的普通六倍体小麦新春24、E28（高淀粉含量组）和宁春16、安农9912（低淀粉含量组）为试验材料,采用实时荧光定量RT-PCR ,对灌浆期籽粒淀粉合成酶相关基因的表达进行研究,并对其表达量与相应酶活性的相关性做了分析。结果表明,束缚态淀粉合成酶基因(GBSS)、可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、淀粉分支酶基因( SBE)、淀粉去分支酶（DBE）基因均呈单峰曲线变化。利用实时荧光定量PCR技术检测9个基因在不同淀粉含量的4个供试品种花后不同时期的相对表达量,结果表明,花后6d这些基因开始表达,在灌浆的中期（花后12~18d不等）有表达的小高峰,但在不同时期,2个高淀粉含量的品种中各种酶活性及其酶基因的相对表达量均比2个低淀粉含量的品种相对较高;这些基因表达谱与酶活性相关分析显示, 除GBSS外其他几种淀粉合成酶基因均与相应酶活性呈显著或极显著正相关,而且GBSS酶活性到达峰值时间稍迟于DBE、SSS、SBE等酶,说明DBE、SSS、SBE基因可能主要通过转录水平来控制籽粒淀粉的合成,而GBSS基因可能主要通过转录后水平来控制籽粒淀粉的合成。     

花生防御素基因的克隆及原核表达

植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

Ri质粒T-DNA对6年生转基因三倍体毛白杨生长和生理性状的影响

为探索外源基因在成年树木中的表达及稳定性,以转Ri质粒6年生三倍体毛白杨成年树木为材料,以同时种植的未转基因三倍体毛白杨为对照植株,对21个转基因株系和对照植株进行外源基因检测和生长、生理特性测定。PCR检测结果证明,Ri质粒T-DNA上的tms、rolC基因在各转基因株系基因组中稳定存在。转基因株系生长受到不同程度影响,各转基因株系的叶柄长、叶片长、叶片宽度和叶面积均小于对照植株,叶片长宽比大于对照植株;71%的转基因株系树高低于对照植株;81%的转基因株系胸径低于对照植株。转基因株系叶绿素a和叶绿素a+b含量、Fv/Fm值、PI值均低于对照植株。81%的转基因株系叶片内源GA3含量及所有株系叶片的内源IAA含量和IAA/ABA比值均高于对照植株,而86%转基因株系叶片的内源ABA含量低于对照植株。T-DNA能够在三倍体毛白杨成年树木中稳定表达,使植物体内内源IAA和GA3含量提高,生长受到抑制,但不同株系存在较大差异。本研究结果为进一步研究外源基因在植物体内的表达调控机制提供了参考依据。     

木糖还原酶基因克隆及重组表达载体的构建

木糖还原酶是木糖醇生物合成的关键酶,催化木糖合成木糖醇。以实验室筛选并经分子生物学鉴定为季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因为基础,以酵母表达载体pPICZαA成功构建了含有木糖还原酶的重组表达载体pPICZαA-xyl,为进一步研究真核表达木糖还原酶和木糖醇的生产奠定基础。