基于酿酒酵母的多片段质粒的构建

为避免现有的多片段质粒构建技术的弊端,提高多片段质粒构建效率,以构建树干毕赤酵母Agglutinin-like基因的敲除载体为例,利用酿酒酵母活体细胞重组系统,一次性将多个外源DNA片段和线性化质粒重组,形成环状质粒。通过引物设计在相互连接的DNA片段之间引入50bp重叠序列,用PCR扩增DNA片段后,与线性化质粒一起转化酿酒酵母,再用PCR和测序等方法鉴定阳性酵母菌落中质粒的正确性。通过本方法构建的多片段质粒正确率高、耗时短。     

Investigating the effects of simulated transport vibration on tomato tissue damage based on vis/NIR spectroscopy

Visible and near infrared (vis/NIR) spectroscopy combined with chemometrics were investigated to evaluate the effects of simulated transport vibration levels on damage of tomato fruit. A total of 280 tomato samples were randomly divided into 5 groups; each group was subjected to vibration at different acceleration levels. A total of 230 samples (46 from each group) were selected as a calibration set; whereas 50 samples (10 from each group) were selected as a prediction set. Raw spectra, differentiation (the first derivative) spectra, extended multiplicative scatter correction (EMSC) processed spectra and standard normal variant combined with detrending (SNV–DT) processed spectra were used for calibration models. SNV–DT processed spectra had the best performance using for partial least squares (PLS) analysis. The PLS analysis was implemented to calibrate models with different wavelength bands including visible, short-wave near infrared (SWNIR) and long-wave near infrared (LWNIR) regions. The best PLS model was obtained in the vis/NIR (600–1600 nm) region. Using a grid search technique and radial basis function (RBF) kernel, four least squares support vector machine (LS–SVM) models with different latent variables (7, 8, 9, and 10 LVs) were compared. The optimal model was obtained with 9 LVs and the correlation coefficient (r), root mean square error of prediction (RMSEP) and bias for the best prediction by LS–SVM were 0.984, 0.137 and 0.003, respectively. The results showed that vis/NIR spectroscopy could be applied as a reliable and rapid method for predicting the effect of vibration levels on tissue damage of tomato fruit.     

OsMAPK7基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsCDPK7基因特异引物通过RT-PCR扩增出1 700 bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该序列与GenBank上的OsCDPK7基因序列相比,缺失了CDS序列中157￣234处的78个核苷酸,其编码的蛋白序列缺失了53￣78的26个氨基酸。但是缺失部分位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性中心和钙结合基序等结构域之外,因此预计该基因产物应具备钙依赖的蛋白激酶活性。进一步将OsCDPK7基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBE12和pB29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsCDPK7基因植物表达载体pBC7E12和pBC729A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsCDPK7基因的功能奠定了基础。     

RNA干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统在纤维素酶研究中的应用前景

植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖,进而发酵产生生物乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。随着生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化的高活力的纤维素酶指日可待。RNA干扰是利用双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,是后基因组时代的一种强有力的调控目的基因表达的实验工具。家蚕杆状病毒表达系统是一种快速、高效表达外源基因的技术手段,目前该系统的发展和应用已经非常成熟。本文综述了纤维素酶的特性以及近年来国内外对纤维素酶、RNA干扰和家蚕杆状病毒表达系统的研究进展,并对该两种实验技术手段在今后纤维素酶研究中的应用前景作了预测和展望。     

转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测

HaPrxQ是参与活性氧清除的重要基因。根据已发表的过氧还蛋白基因序列,设计特异引物,扩增到完整的HaPrxQ基因;构建植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥并获得了9份转HaPrxQ基因苗。     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。     

大白菜开花基因 LFY的克隆及dsRNA抑制载体的构建

以中国大白菜花蕾为材料,通过RT-PCR方法,参照GeneBank公布的序列克隆了Leafy(简称LFY)基因片段,测序分析结果表明,该基因与国外已经报道的序列具有94％的同源性。将此序列以相反方向插入到植物表达载体pROK2 35S启动子之间,并在2反向重复片段之间插入小麦乙酰辅酶A羧化酶的第20内舍子,从而构建了dsRNA抑制双元载体,该载体的构建为通过农杆菌介导转化大白菜进而解决早春扣反季栽培大白菜的先期抽薹问题创造了条件。     

大麦脱水可诱导启动子的克隆及其瞬间表达载体的构建

为进一步研究脱水可诱导启动子的结构和功能,并为开展禾谷类植物转基因研究选择启动子提供依据,用大麦品种撒哈拉幼苗提取的总DNA为模板,利用设计合成的引物对进行PCR定向扩增,获得了HVA1s、Dhn4s和Dhn8s启动子片段。通过分离、纯化、酶切和连接,把启动子片段分别插入到带有GFP和GUS报告基因的表达栽体质粒中。经测序确认,目标启动子片段与原报道的同源启动子序列一致性达95．3％以上。HVA1s、Dhn4s和Dhn8s启动子在构建的瞬间表达载体pHVA1sGFPG、pDhn4sGFPG、Dhn8sGFPG和pHVA1sGUSR、pDhn4sGUSR、pDhn8sGUSR中,都具有启动表达报告基因的能力,通过基因枪转化大麦幼苗可有效启动gfP和gus基因瞬间表达。     

基于野外VIS-NIR光谱的土壤盐分主要离子预测

为明确干旱区土壤盐分主要离子的特征光谱,建立精度高和稳定性好的盐渍土预测模型,以新疆阜康市为研究区域,采用网格法采集55个土壤样本,利用实测VIS-NIR光谱,选择多元线性回归(MLR)、支持向量机(SVM)、随机森林(RF)法构建土壤盐分主要离子含量反演模型,而后对反演精度进行检验。结果显示:(1)在0.01显著水平下,土壤盐分与Na⁺、Cl^–、Ca²⁺含量均呈显著相关,相关系数分别为0.978、0.814、0.645;(2)综合光谱响应和相关性分析确定土壤盐分主要离子的特征波段为459、537、1 381、1 386 nm,显著特征波段为459、537 nm;(3)3种模型拟合效果从高到低依次为RF>MLR>SVM,采用RF所建模型盐分主要离子(Na⁺、Cl^–、Ca²⁺)R²最高,RMSE最小,RPD最大,分别为2.11、2.03、1.80,为最优预测模型。通过选取土壤主要离子显著特征波段,进而采用RF法构建其估测模型...     

滇西北4个高原湖泊演变特征及其驱动因子

基于纳帕海、属都湖、碧塔海和剑湖4个高原湖泊矢量数据,利用Arc Map 10、Fragstats 3.3、Excel等软件,系统分析了1955~2012年4个高原湖泊水域面积和形状的时空演变规律及其驱动因子。结果表明,(1)湖泊时空演变规律各异。纳帕海水域面积和形状复杂程度都处于无规律的波动变化过程中。属都湖水域面积和形状复杂程度1955~1994年都处于增加状态,1994~2011年保持不变。碧塔海水域面积和形状复杂程度没有发生变化。剑湖水域面积1957~2012年呈减少趋势,形状复杂程度呈增加趋势。(2)时空变化程度各不相同。4个高原湖泊时空变化程度从大到小的排序为纳帕海﹥剑湖﹥属都湖﹥碧塔海。(3)演变驱动因子不尽一致。纳帕海的驱动因子主要为疏浚落水洞、建闸控水、泥沙淤积、改造河道、气候变化、湖水污染和旅游干扰。剑湖的驱动因子主要为疏浚河道、泥沙淤积、湖滩开发、建闸控水、气候变化和湖水污染。属都湖的驱动因子主要为筑坝蓄水。人为干扰和气候变化没有导致碧塔海湖泊的变化。(4)受人为干扰程度有差异。4个高原湖泊受人为干扰程度由重到轻的排序为纳帕海﹥剑湖﹥属都湖﹥碧塔海。