猪圆环病毒2型BF株ORF2基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR从构建的猪圆环病毒2型／(PCV2)ORF2重组质粒(pGEM-T-ORF2）中扩增出大小为593bp的ORb2基因，克隆到表达载体pET-32a，经异丙基硫代半乳糖苷诱导，成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白，分子量40kD，表达量20％左右。经Western blot检测，重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

mcr-1阳性类噬菌体质粒与F33:A-:B-质粒共整合形成的融合质粒的生物学特性分析

为了分析猪源大肠杆菌中mcr-1阳性不可接合类噬菌体质粒pD72-mcr-1与blaCTX-M-55阳性可接合的F33:A-:B-质粒pD72-F33融合形成的共整合质粒pD72C的生物学特性,评估该融合质粒对mcr-1传播的潜在作用,本实验采用生长曲线测定、质粒稳定性实验、竞争性实验和接合实验,测定了融合质粒pD72...     

大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立

比较了不同方法制备的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,并优化了质粒DNA转化感受态细胞体系。结果表明:高效法制备的感受态细胞转化效率极显著高于普通法制备感受态细胞的转化效率,其效率提高了966.1%,而高效法感受态细胞转化效率与商品化的感受态细胞转化效率差异不显著。-80℃超低温长期保存时,相比较于15%甘油,以7%DMSO为冻存保护剂保存的感受态细胞其转化效率达到1.1×107,较15%甘油冻存保护剂保存的转化效率提高了69%。温浴5 min,冰浴10 min时,其转化效率最高,达到4.95×107。应用高效法制备的感受态细胞转化不同大小质粒的效率极显著高于普通大肠杆菌感受态细胞,其转化效率较普通大肠杆菌感受态细胞的提高了550%,而转化时间缩短至普通大肠杆菌感受态细胞的12.5%,仅为15min。     

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)质粒复制基因repC序列多样性的研究

采用质粒快速检测法从供试33株费氏中华根瘤菌中分别检测出2～4个内源大质粒。用根据豌豆根瘤菌的repC基因设计1对引物RCI和RC3,从供试菌株及3株华癸中生根瘤菌和1株大豆慢生根瘤菌中扩增得到repC基因片段,证明在费氏中华根瘤菌中广泛存在repC基因。通过对扩增产物的测序,并与已报道的repC基因序列进行聚类分析,发现供试菌株可分为2个群,群a和群b,群内十分保守,但群间差异明显;其中群b的序列与已知类型的差异明显。     

设计表达兔防御素基因NP1

利用计算机软件对在将大肠杆菌中表达的兔防御素NP-1基因进行分析。消除宿主菌不表达或低效表达的密码子。同时对NP-1基因与质粒pGEX-4T-1中融合基因GST。进行RNA二级结构预测，通过对RNA二级结构进行分析，消除可能影响基因表达的二级结构，设计了有利于今后对目的基因的表达的兔防御素基因，并在大肠杆菌高效表达。结果表明：合成基因可以在大肠杆菌中高效表达。     

抗铅联合苯酚降解多功能菌的构建

采用质粒消除技术对Pb抗性菌和高效酚降解菌的抗铅降酚基因进行定位,提取高效酚降解菌降解质粒,将其转化到Pb抗性菌中进行遗传重组,研究多功能菌在重金属铅与酚类物质同时存在的体系中污染物质去除转化能力,同时研究抗重金属铅联合酚降解转化菌株中转化质粒的存在情况。结果表明抗铅菌株的抗铅功能与质粒存在无关,而高效降酚菌降酚基因位于质粒上;获得了降酚抗铅转化子,经驯化筛选出的转化子在铅浓度100mg.L-1时可将500 mg.L-1苯酚降解率达到95%以上,说明构建的抗铅降酚工程菌铅具抗性具降解苯酚功能。经分子验证,高效降酚菌的质粒DNA已经进入抗铅菌体内,并得到一定表达。     

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析

本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离白海南岛的12个反菌株与分离自广西、黑龙江的5株＆菌株及2株胁模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析。19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱,充分显示出不同来源肪菌株的质粒多样性。进一步选择了其中的10个菌株,利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）,结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性。但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异。研究结果初步证实海南分离株S3078—1是一株无内生质粒的助菌株,而S3031-1和S3073—1两个分离株仅有一个大质粒存在,这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株。本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性。     

盐单胞菌C6受渗透调节的质粒的抗性分析

通过对盐单胞菌（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｃ６的抗性研究,发现该菌对３种氨基糖甙类抗生素（卡那霉素,新霉素的庆大霉素）的抗性反应受渗透压调节。在低盐浓度条件下,对这些抗生素敏感,但在高盐浓度下,该菌能抗一定浓度的这类抗生素。Ｃ６的细胞质粒ｐＷＨ１,转化大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α后得到３种对上述抗生素有不同反应的转化子,表明Ｃ６对这种３种抗生素的抗性是由该质粒决定的。     

实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV

根据GenBank发表的PRRSV、CSFV基因核苷酸序列,应用Primer 5.0软件分别设计了2对特异性引物.以重组质粒作为阳性标准品,应用SYBR Green I real-time PCR检测两种病毒的核酸含量.在样品稀释到10.1～10<'-11>拷贝时,能得出良好的线性关系,相关系数为R<'2>=0.999...     

H9N2亚型禽流感病毒HA检测片段阳性质粒的构建

本试验按照农业部NYT 772─2013标准构建了长度为487 bp的H9N2亚型禽流感病毒HA检测片段阳性质粒,并对该阳性质粒的特异性、敏感性和重复性进行了鉴定,获得了可用于检测H9N2亚型禽流感病毒HA片段的阳性质粒。该质粒在-20℃下即可保存,使用方便,不会污染环境,不存在散播病毒的危险。