犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究

本研究根据酵母系统密码子的偏嗜性,对成熟蛋白基因核苷酸序列进行密码子偏嗜性改造,利用毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC来表达犬IFN-α成熟蛋白基因。并采用非洲绿猴肾细胞(Vero) -水疱性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法为基础来测定重组犬α干扰素的效价,同样方法测定了表达产物对PRV和CDV的抑制作用。本试验实现了犬α干扰素在酵母中的高表达,表达量高达58 mg/L,SDS-PAGE检测大小约为24 ku,比预测分子质量大,推测发生了糖基化。表达产物具有较强的种属特异性,在Vero细胞上对PRV具有较高的抗病毒活性,达到了3.6×10⁷ U/L,对CDV也有很好的抑制作用。本研究为犬IFN-α以后的临床应用研究奠定基础。     

鸡突变型和未突变型Mx蛋白体外抗病毒活性研究

【目的】研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸变异与抗病性的相关性。【方法】用已经构建成功的中国狼山鸡Mx蛋白基因突变型pcDNA3.0-MMx和未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体分别转染鸡成纤维（CEF）细胞和鼠成纤维（NIH-3T3）细胞;利用RT-PCR检测突变型MMx基因和未突变型Mx基因的表达,微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒（NDV）和水泡性口炎病毒（VSV）的效果。【结果】诱变鸡Mx基因的表达重组蛋白可保护CEF细胞在孵育48 h内免受NDV的感染;转染突变型pcDNA3.0-MMx真核表达载体的NIH-3T3细胞在孵育60 h内亦未受到VSV的浸染;而转染未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体的CEF和NIH-3T3细胞在24 h内均发生了病变。【结论】体外重组突变的Mx蛋白在单细胞水平上具有延缓NDV和VSV感染的能力。     

禽类Toll样受体研究进展

Toll样受体(TLRs)是模式识别受体家族的一员,在天然免疫反应中扮演重要角色。在禽类中至今已发现10种TLRs。研究表明在机体感染病原体时,将激活TLRs并引起一系列抗病毒相关因子的上调,参与宿主抗感染免疫反应。论文主要介绍禽类TLRs的基本特征及抗病毒信号转导通路,同时对TLRs的抗微生物作用进行分析,为TLRs的分子机制研究提供参考。     

高比活度碳-14标记毒氟磷的合成与分析

以[14C]碳酸钡为放射性同位素原料,通过格氏反应、Curtius重排、亲核加成、硫代及关环等7步反应,制备了同位素碳-14标记的毒氟磷粗品,经反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化获得标记物纯品14C-毒氟磷（N-[2-（4-甲基苯并[2-14C]噻唑基）]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基甲基膦酸酯,38.3 mCi）。7步反应的化学收率/放化收率为10%。其结构经核磁共振氢谱、质谱和放射性高效液相色谱（HPLC-FSA）分析确认。放射性薄层成像分析（TLC-IIA）、高效液相色谱-液体闪烁测量联用分析（HPLC-LSC）、高效液相色谱-流动液体闪烁测量/二极管阵列检测器/质谱联用分析（HPLC-FSA/PDA/MS）和LSC分析表明,14C-毒氟磷的放化纯度和化学纯度均大于98%,比活度为58.0 mCi/mmol,可作为放射性示踪剂,用于毒氟磷的代谢和环境行为等研究。     

Nonapeptide突变体制备及抗新城疫病毒活性研究

以生物工程技术表达及120 g/L SDS-PAGE电泳纯化Nonapeptide突变体,取制备的Non-apeptide突变体进行抗新城疫病毒(NDV)的鸡胚试验、鸡体内抗NDV试验。结果表明,当Nonapeptide突变体基因产物浓度达4μg/mL～6μg/mL,对鸡胚保护率均达到100%,感染鸡胚全部存活;Nonapeptide突变体基因产物浓度大于4μg/mL,对NDV有很好的抑制作用,鸡用药后3 d体内检测不到NDV,低剂量组(2μg/mL)也有较好的抑制NDV作用,鸡用药后5 d体内检测不到NDV。Nonapeptide突变体基因产物具有NDV多克隆抗体相似活性,能够抑制鸡胚中和组织培养中NDV的繁殖,具有中和、抑制NDV吸附作用。     

犬α-干扰素蛋白在不同表达载体中的生物学活性比较

根据GenBank中公布的犬α-干扰素（CaIFN-α）基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a（His标签）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a（His标签）连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×10⁶ U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。     

辣蓼黄酮正丁醇部分体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

为明确辣蓼黄酮正丁醇部分（n-butanol part of flavonoids from Polygonum hydropiper L.,FNB）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）的效果。本研究以Marc-145细胞和PPRSV弱毒疫苗毒株（TJM-F92）为对象,通过CCK-8法检测FNB对细胞的毒性作用,并检测先给药后接毒、先接毒后给药、药物与病毒同时作用这3种方式处理细胞后药物对病毒的抑制率。结果发现,FNB对细胞的最大安全浓度为500 μg/mL,因此,选择25~500 μg/mL浓度范围的FNB进行后续试验。各浓度的FNB处理病毒后,能不同程度的抑制PRRSV在细胞上的增殖,并呈现一定的剂量效应关系,药物的浓度越高,抗病毒效果越好。其中,先接毒后给药、药物与病毒同时作用这两种方式抗PRRSV效果显著,在25~500 μg/mL浓度范围内细胞存活率分别为21.55%~65.23%和24.85%~73.60%。而先给药后接毒,不能有效降低病毒的感染力,在药物最高剂量（500 μg/mL）时细胞存活率仅为7.00%,抗病毒效果不明显。FNB预先作用于Marc-145细胞虽未降低PRRSV感染细胞的能力,即药物对于PRRSV预防作用效果不理想,但是FNB对病毒感染细胞后呈现一定的作用,药物能够通过抑制病毒的合成、释放及直接杀灭病毒,进而能够有效抑制PRRSV在细胞上的增殖。本试验结果不仅为FNB在临床上治疗猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供参考依据,而且可以为辣蓼的深度开发和利用提供理论依据。     

猪呼吸道疾病综合征药物防控技术研究进展

猪呼吸道疾病综合征（PRDC）在养猪业中广泛流行,发病原因复杂,由多种细菌、病毒、寄生虫及环境应激等因素共同引发,普遍造成猪生长迟缓和猪肉品质下降,还有相当比例的病猪死亡,严重影响养猪业的发展。胸膜肺炎放线杆菌（APP）、副猪嗜血杆菌（Hps）、链球菌（SS）是常见的细菌性病原,而猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）是常见的病毒性病原,合理用药防治PRDC十分关键。头孢喹肟、氟苯尼考及加米霉素等抗生素因抗菌谱广、抗菌活性强、在猪体内药代动力学特征优良等优点被广泛用于防控细菌性感染的猪呼吸道疾病。对于病毒性感染的猪呼吸道疾病,常用的抗病毒药物有细胞因子及中药,尤其是中药,不仅可以抗病毒还可增强机体免疫力,应用前景非常广阔。文章系统地阐述了上述抗菌药物的抗菌机理、药效学及药动学,详细介绍了上述抗病毒药物的抗病毒机理及其在病毒性猪呼吸道疾病上的应用,以期为合理用药防控PRDC提供一定的建议。     

番茄双链RNA绑定蛋白(SlDRB)基因家族鉴定及抗TYLCV防御反应分析

番茄生产是现代蔬菜生产的主导产业,因经济价值高,成为乡村振兴的优势产业.然而番茄生产大多面临番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)和其他病毒的严重威胁.最新研究发现双链RNA结合蛋白(DRB)在植物RNA干扰(RNAi)抗病毒通路中发挥重要作用.为探究番茄DRB(SlDRB)基因抗TYLCV防御反应,本研究通过生物信息学方法鉴...