氟苯尼考胁迫下弗氏柠檬酸杆菌转录组测序研究

为了探究弗氏柠檬酸杆菌的耐药机制，试验使用氟苯尼考为诱导药物，提取正常培养与400 μg/mL氟苯尼考胁迫下的菌株RNA，利用转录组测序技术对菌株间基因表达水平与差异表达基因进行了分析。结果显示，每个样品平均产出1.31 Gb数据，与参考基因组的平均比对率为67.01%。对样品间差异表达基因进行检测，共筛选出2 019个显著差异表达基因，其中上调963个，下调1 056个，并发现emrA和emrB 2个基因。KEGG Pathway分析中，富集到代谢途径的显著差异表达基因最多，占全部的72%，碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢、膜转运等通路明显富集。GO功能分析中，生物过程分布的显著差异基因最多，占全部的46%。显著差异表达基因主要涉及到代谢进程、催化活性、结合。本试验结果表明，弗氏柠檬酸杆菌耐药性的产生可能与细胞外排泵介导的主动外排作用、靶位改变、酶的水解作用、细胞膜通透性改变及生物膜的形成有关。     

牦牛卵泡发育过程中卵丘卵母细胞复合体的转录组分析

为探讨牦牛有腔卵泡发育过程中卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)mRNA转录组变化,对牦牛小(2~3 mm)、中(4~5 mm)、大有腔卵泡(6~8 mm)中的COCs进行Illumina平台测序,筛选差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),并进行GO分析和KEGG分析。结果表明,1)牦牛小、中、大3个阶段的卵泡COCs中共有17 342个基因表达;2)小卵泡与中卵泡COCs之间有879个DEGs,其中,上调435个,下调444个;DEGs注释到106条GO条目,其中生物过程(BP)类别46条,细胞组成(CC)类别25条,分子功能(MF)类别35条,涉及254条KEGG通路。中卵泡与大卵泡COCs之间有1 560个DEGs,其中,上调590个,下调970个;3)DEGs注释到114条GO条目,其中BP 55条、CC 26条和MF 33条,涉及276条KEGG通路,DEGs主要富集在神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子、钙离子信号通路和cAMP信号通路等重要通路。综上,牦牛卵泡在不同发育阶段的DEGs、GO条目和KEGG pathway存在明显差异,为揭示牦牛卵泡发育分子调控机制,改善牦牛卵母细胞体外成熟技术提供了理论依据。     

miR-92a对奶山羊乳腺上皮细胞增殖及凋亡的调控分析

miRNAs是对哺乳动物乳腺组织发育及泌乳机能进行调控的重要因子。本研究依据已有的关中奶山羊乳腺组织miRNA表达谱,选择不同泌乳时期差异表达的miR-92a为研究对象,探究miR-92a对山羊乳腺上皮细胞（GMEC）增殖及凋亡的调控作用,并挖掘其潜在的调控基因。采用荧光定量PCR、MTT检测、EdU检测及流式细胞术,检测miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织的表达情况,并在细胞水平检测miR-92a对乳腺上皮细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用。利用RNA-seq技术,分析过表达miR-92a乳腺上皮细胞中的差异表达基因。qRT-PCR结果显示,miR-92a在奶山羊泌乳初期乳腺组织中表达量极显著高于泌乳中期（P<0.01）,表明miR-92a可能对奶山羊泌乳性状有重要的调控作用。GMEC过表达miR-92a后,试验结果显示：与NC对照组比较,miR-92a过表达组的EdU阳性细胞数极显著减少（P<0.01）,S期的细胞数显著下降、G1期的细胞数显著增加,同时miR-92a组的凋亡细胞数目显著增加（P<0.05）。采用RNA-seq,构建了miR-92a过表达mRNA文库,发现下调基因54个,上调基因160个。GO terms及KEGG通路分析显示差异表达基因调控乳腺上皮细胞多种生物学功能。以上结果表明miR-92a促进GMEC凋亡、抑制其增殖,测序结果进一步证明miR-92a对奶山羊乳腺发育及泌乳性能具有潜在的调控作用。     

基于RNA-Seq数据分析葡萄糖诱导绵羊卵泡颗粒细胞衰老的差异表达基因

【目的】 探讨葡萄糖对绵羊卵泡颗粒细胞衰老及其基因表达的影响。【方法】 将原代分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分别用含17.5(H组)和2 mmol/L(L组)葡萄糖的培养基进行体外培养, 细胞处理72 h后, 利用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老, 采用RNA-Seq技术进行转录组测序, 对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 并用实时荧光定量PCR验证锚定蛋白重复域蛋白1(ANKRD1)、白细胞介素8(IL-8)、催产素(OXT)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)基因的表达量。【结果】 H组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率极显著高于L组(P<0.01)。转录组测序结果显示, 两组间存在401个差异表达基因, 其中上调基因153个, 下调基因248个, 高糖诱导的细胞异常相关基因9个, 细胞周期相关基因6个。GO功能富集分析发现, 差异表达基因参与了细胞过程、生物调节、代谢过程、多细胞生物过程及细胞运动等生物过程, 在细胞成分上主要富集在胞外区、膜、突触、细胞器及超分子复合体等, 在分子功能主要富集在催化活性、整合、转运活性、分子功能调节剂及结构分子活性等。KEGG信号通路富集分析发现, 差异表达基因主要富集在糖尿病并发症中的晚期糖基化产物(AGE)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路等。实时荧光定量PCR结果表明, 与L组相比, H组IL-8基因表达水平极显著上调(P<0.01), ANKRD1基因表达水平显著上调(P<0.05), OXT基因表达水平极显著下调(P<0.01), NOX4基因表达量呈上升趋势, 但差异不显著(P>0.05), 实时荧光定量PCR结果与转录组测序结果一致。【结论】 17.5 mmol/L葡萄糖可诱导绵羊卵泡颗粒细胞衰老及衰老相关基因表达变化, 为葡萄糖诱导颗粒细胞衰老的功能和分子机制提供了依据。     

基于瘤胃转录组探究双峰驼沙漠适应性分子机制

旨在比较胚胎期和成年期双峰驼瘤胃在组织形态、编码基因表达上的变化,挖掘影响双峰驼瘤胃发育的关键基因和通路,从消化系统探究双峰驼的沙漠适应性机制。本研究选取3峰10~12岁健康状况良好的成年期阿拉善双峰驼,以及3峰9~10月龄健康状况良好的胚胎期阿拉善双峰驼,采集瘤胃组织样品,制作石蜡组织切片,观察成年期与胚胎期双峰驼瘤胃,比较其组织结构之间的差异。分别提取成年期和胚胎期双峰驼的瘤胃组织总RNA,利用Illumination Hiseq 2000测序平台分别进行转录组测序,对转录组数据进行质控、比对、差异基因筛选、GO、KEGG富集分析。随机选择6个差异表达基因进行荧光定量试验,关联转录组数据与荧光定量试验的表达趋势。结果表明,胚胎期瘤胃组织中上皮细胞和肌纤维细胞清晰可见,分布密集,在成年期的瘤胃组织中,可见明显的肌纤维,肌纤维直径较宽,肌纤维间的空隙较大。转录组测序结果显示,每个样本获得至少10G的数据量,各样本的质控率都在90%以上,Q30数据都在88%以上。对测序数据进行分析,以胚胎期为对照组,成年期为试验组,筛选到1 207个差异表达基因,其中上调基因456个,下调基因751个;对差异表达基因进行层次聚类分析,结果显示,成年期的3个个体（M1、M2、M3）表达模式接近,胚胎期的3个个体（T1、T2、T3）表达模式接近。对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示,上调差异表达基因显著富集到62条显著的GO条目,下调差异表达基因显著富集到366条显著的GO条目,73条显著的KEGG通路。差异表达基因主要富集在代谢过程的负调控、RNA生物合成过程的负调控、基因表达的负调控等GO条目中,KEGG主要富集到MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号、胰岛素信号通路、醛固酮的合成与分泌等通路中。同时筛选到MAPK12、MAPK13、FABP5、PPARγ、CaMK1等与双峰驼沙漠适应性相关的基因。荧光定量结果显示,差异基因在成年期和胚胎期瘤胃组织中的表达模式与RNA-Seq的结果一致。上述结果表明,双峰驼的瘤胃组织可能与脂肪细胞分化有关。在沙漠环境中,双峰驼可能降低瘤胃组织代谢效率、通过胰岛素抵抗作用提高血糖耐受性以及促进醛固酮的合成与分泌以调节血压平衡,以更好地在沙漠干燥缺水的环境中生存。     

基于RNA-Seq技术的京海黄鸡卵巢组织转录本预测及新基因挖掘

鸡及许多物种的全基因组测序及相关基因图谱都已宣告完成,但由于注释方法的局限性,还存在许多遗漏的新基因及对现有基因的误差注释。RNA-Seq技术是基于第2代测序技术的转录组学研究方法,该研究利用高通量测序技术对8只（高产组4只、低产组4只）300日龄体重一致、饲养条件相同、产蛋数存在差异的京海黄鸡的卵巢组织所有RNA反转录而成的cDNA文库进行测序,通过分析RNA-Seq获得的京海黄鸡卵巢组织转录组数据,共发现4 431个新转录本,并将所有新转录本与GO、NR、Swiss-Prot、KEGG数据库进行比对和分析,发现了很多潜在的新基因并进行功能注释,为鸡基因组的进一步完善及功能基因的挖掘提供了数据基础。     

小麦矮秆突变体DC20的转录组分析

为探明小麦矮杆突变体DC20致矮的分子调控机制,以小麦D6-3(WT)及其经高能混合粒子场诱变处理得到的矮秆突变体DC20为试验材料,通过对突变体DC20和WT的转录组分析,挖掘与DC20致矮相关差异表达基因。结果表明,在株高差异起始的孕穗期茎秆中,DC20与WT之间存在2 153个差异表达基因(DEGs),除参与糖代谢、能量代谢、转录调控、转录后修饰和翻译及翻译后修饰途径外,其中有47个差异表达基因显著富集在植物激素GAs的生物合成和IAA的动态平衡调节及信号转导、细胞周期调控以及细胞伸长等相关途径。大部分差异表达基因表现为表达下调,少量抑制因子的表达量上调。内源植物激素检测结果显示,DC20孕穗期茎秆中的IAA、GA₁和GA₃含量均显著低于WT。表明辐射诱变处理产生的变异是通过植物激素GAs与IAA的协同作用,调控细胞周期以及细胞伸长等途径相关基因的下调表达,从而对DC20的株高产生影响,形成矮化表型。本研究结果为更好地运用辐射诱变育种手段进行作物育种以及阐明矮秆突变体形成的分子调控机理研究提供了一定的理论依据。     

猪circ0015292的鉴定及其在卵泡中的表达研究

试验旨在通过高通量测序及生物信息学分析circRNA在猪卵泡发育过程中的作用及其可能的机制,为进一步探索circRNA对猪卵泡发育的调控机理奠定生物学基础。采集梅山和杜洛克猪不同级别的卵泡及各组织样本,提取总RNA,采用RNA-Seq技术对卵泡中差异表达的circRNA进行筛选,同时验证并分析其在梅山猪和杜洛克猪卵泡中的表达情况,并用实时荧光定量PCR进行组织表达谱分析。结果显示:试验证实了circ0015292的存在,且其在肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、输卵管、子宫、垂体及下丘脑中均有不同程度的表达,在心脏、脾脏、肺脏、卵巢中的表达量相对较高;circ0015292在梅山猪S卵泡中的表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),在杜洛克猪M1、M2、L卵泡中的表达量均显著高于梅山猪(P<0.05);其潜在靶基因GADD45G、CCR2、IL20RB、CFL1、LAMB3与猪的卵泡发育相关。综合试验结果,circ0015292在不同组织、不同时期卵泡中均有不同水平的表达;部分靶标基因参与细胞周期及卵巢发育相关信号通路,提示其可能通过对靶基因的调控作用间接参与卵泡发育过程,这为猪繁殖机理的研究提供了新思路。     

杧果果实响应1-MCP处理的数字基因表达谱分析

以‘台农1号’杧果为试材,用1–甲基环丙烯（1-MCP,1 μL · L-1）常温下处理12 h和未处理的果实为对照,通过数字基因表达谱（DGE）技术,寻找1-MCP处理对杧果贮藏影响的潜在关键基因。DGE数据分析结果表明,1-MCP处理与对照样品文库相比,共检测到7 350个差异表达基因。其功能主要涉及细胞壁代谢,激素调节,逆境胁迫应答,氧化损伤保护,能量代谢,蛋白质折叠,泛素化和蛋白酶体途径介导的细胞程序性死亡,成熟与衰老调控等。利用实时定量PCR（qRT-PCR）技术对DGE部分数据进行验证,检测了其中6个较有代表性的应答基因的差异表达。通过基因本体（Gene Ontology,GO）通路功能富集分析表明,1-MCP处理增加果实对逆境胁迫的抵抗能力,抑制物质和能量代谢,减少细胞内钙的流失并保护果实细胞。qRT-PCR技术数据支持RNA-Seq的检测结果。