葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。     

氮素化学形态及添加剂量对温带森林土壤N2O排放的影响

土壤中氮形态和氮剂量的有效性是影响土壤氧化亚氮(N₂O)排放的重要因子。为了提高氮素化学形态及添加剂量对温带森林土壤N₂O排放的影响,本研究在北京林业大学实验林场,以温带油松林土壤为研究对象,通过野外氮添加控制实验,采用静态箱/气相色谱法分析不同水平(对照,CK:0 kg/(hm2·a); 低氮,LN:50 kg/(hm2·a); 中氮,MN:100 kg/(hm2·a); 高氮,HN:150 kg/(hm2·a))和不同形态(混合态氮,AN:NH₄NO₃; 铵态氮,As:(NH₄)₂SO₄; 硝态氮,Na:NaNO₃)的氮添加对温带油松林土壤N₂O排放通量的影响。结果表明:氮添加处理样地N₂O排放表现出明显的季节性变化特征,排放高峰出现在6—8月,其他季节土壤N₂O排放通量相对较低,最小值出现在1月。不同氮添加处理均促进了土壤N₂O的排放:在不同水平的氮添加下,随着氮添加水平的增加,土壤N₂O排放通量也升高,表现为HN＞MN＞LN＞CK。不同形态的氮输入对N₂O排放的促进作用表现为:AN＞As＞Na,As添加与AN和Na添加没有显著差异(P>0.05),但AN添加与Na添加之间差异显著(P＜0.05)。此外,空气温度、土壤温度和土壤孔隙含水量也可以影响土壤N₂O的排放。年度土壤N₂O排放系数范围是0.34%~0.94%,年均排放系数为0.364%,低于联合国政府间气候变化委员会(IPCC)推荐的默认值。      

氮肥品种和含水量对水稻土N2O排放速率及排放过程的影响

稻田是全球重要的N_2O排放源,氮肥有效性和水分状况是影响稻田N_2O排放的关键因素。为探明水稻土在施用尿素和硫酸铵时,水分变化对短时间内N_2O总排放速率及不同硝化过程(自养硝化、异养硝化、非生物作用)贡献的影响,通过室内培养实验,采用乙炔抑制法,测定了不同时间段N_2O释放量,并计算释放速率。结果表明:施用氮肥可以显著提高自养硝化、异养硝化及总过程的N_2O排放速率,并且施尿素处理N_2O排放速率大于施硫酸铵。随着土壤水分含量由48%增加至160%,总N_2O排放速率以及自养硝化、异养硝化N_2O排放速率显著增加。供试水稻土N_2O的产生主要是由生物过程主导的,其中硝化作用(包括自养硝化、异养硝化)最高贡献达51.1%,非生物作用贡献所占比重很小。这些结果可为科学施肥,降低农田土壤N_2O排放提供科学依据。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

夜香树DXS2基因的克隆与表达分析

[目的]克隆夜香树(Cestrum nocturnumL.)萜类香气物质代谢途径关键限速酶DXS2(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 2)基因全长cDNA,并对该基因进行生物信息学分析,检测该基因在开花不同时间及叶片中表达量的动态变化。[方法]采用RTPCR与RACE相结合的技术,获得夜香树DXS2的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析,qRT-PCR分析其在盛花期不同时间花和叶中的表达量。[结果]获得CnDXS2基因全长序列2 370 bp,其中ORF 2 145 bp,编码714个氨基酸,含DXP-synthase-N、TPP-PYRDXS-TK-like和Transketolase-C等保守结构域,与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis L.)DXS2蛋白同源性达93%,推测属于Ⅱ类DXS蛋白;qRT-PCR分析表明,CnDXS2在叶中表达量总体高于花,花中22∶00表达量最高,14∶00表达量最低,具有节律性。[结论]萜类MEP代谢途径基因CnDXS2的克隆与表达分析为从分子方面揭示CnDXS2基因在萜类香气代谢途径中的功能提供了依据,有助于夜香树花香萜类代谢途径基因功能和花香基因工程的研究。     

Cu2+和Pb2+对石蚕蛾幼虫的急毒性研究

[目的]研究Cu~(2+)和Pb~(2+)对石蚕蛾幼虫的急毒性效应和安全浓度。[方法]从广西十万大山保护区采集石蚕蛾(Stenopsyche marmorata)幼虫,采用静水生物毒性试验法进行重金属离子Cu~(2+)和Pb~(2+)对其的急毒性试验。采用概率单位法分别计算Cu~(2+)和Pb~(2+)对石蚕蛾幼虫的半致死浓度和安全浓度。[结果]Cu~(2+)对石蚕蛾幼虫的24、48、72、96 h的半致死浓度(LC50)分别为123.651、112.975、84.536和70.509 mg/L,Pb~(2+)对石蚕蛾幼虫的24、48、72、96 h的半致死浓度(LC50)分别为49.138、41.878、30.735和29.245 mg/L。Cu~(2+)和Pb~(2+)对石蚕蛾幼虫的安全浓度分别为7.051和2.925 mg/L。[结论]研究结果可为将石蚕蛾幼虫用作水体重金属污染指示生物提供科学依据。     

猪圆环病毒2型体外诱导RAW264.7细胞氧化应激模型的建立

[目的]探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性,为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据.[方法]PCV2原液调至5×106/mL,经10、102、103和104倍稀释(10-1、10-2、10-3和10-4释度)后,感染作用RAW264.7细胞2h,弃病毒液,加入含5% FBS的DMEM培养液继续培养,分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞,测定一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等指标.[结果]10-1PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高细胞NO、ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG,升高细胞XOD、MPO和iNOS活性,表明以10-1pcv2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态,诱导细胞产生氧化应激.[结论]PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激,并确立10-1 PCV2(5× 105/mL)体外感染RAW264.7细胞4~24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件.     

白茄新品种白玉2号的选育及栽培技术

[目的]选育出适合我国华南地区种植的果底钝、果横径大、光泽度好、产量高、抗病强的白茄新品种,为华南地区白茄生产发展提供优良品种.[方法]以抗青枯病优质自交系紫花矮白茄为母本,创新资源丰白为父本配制杂交一代组合,对其组合力进行测定,并进行品种比较试验和区域试验.[结果]选育的白玉2号总产量比对照品种白玉白茄极显著增产27.4%(P<0.01,下同),果长(28.8 cm)、果横径(5.4 cm)和单果重(296 g)分别比对照品种白玉白茄增加7.5%、31.7%和42.3%;果底钝,果面平滑、着色均匀,光泽度好,且感观品质和理化品质均较优.区域性试验结果显示,春、秋季白玉2号总产量(41.56和38.28 t/ha)分别比对照品种象牙白茄增产9.6%和3.7%,但差异未达显著水平(P>0.05),春季总产量比对照品种紫荣8号极显著增产22.5%;田间表现中抗青枯病.该品种于2016年通过广东省农作物品种审定委员会审定.[结论]选育的白玉2号适应性广、中抗青枯病、产量高,果实外观品质和理化品质均较优,适合华南地区春季和秋季露地栽培.     

广西首例猪圆环病毒3型的发现及其衣壳蛋白序列分析

[目的]明确猪圆环病毒3型(Porcine circovirustype 3,PCV3)在广西猪群中的致病性及流行病学特点,为有效防控其暴发流行提供参考依据.[方法]采用PCR对广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品进行PCV3检测,并对其唯一结构蛋白质(Cap)的结构进行同源模拟,构建遗传进化树;同时在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测Cap蛋白信号肽、糖基化位点和B细胞抗原表位.[结果]在广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV3.PCR扩增产物经核苷酸序列测定分析后截取Cap基因序列(645 bp),命名为PCV3/CN/Guangxi001/2017.PCV3/CN/Guangxi001/2017与13株国内PCV3毒株和5株美国PCV3毒株的Cap基因序列同源性分别在96.9%~99.4%和98.3%~99.5%,属于3b亚群;而与PCV1毒株和PCV2毒株的核苷酸序列同源性只有43.0%和45.8%,且B细胞抗原表位差异明显,在PCV1特有的B细胞抗原表位(92~103 aa)、PCV2特有的B细胞抗原表位(69~83 aa、117~131 aa和231~233 aa)及PCV1、PCV2共有的B细胞抗原表位(156~162 aa和179~192 aa)均无相似性.[结论]广西猪群中已存在PCV3感染,鉴于PCV2与PCV3间无交叉免疫保护特性,实际生产中应通过加强清洁消毒、灭鼠杀虫、定期监测、自繁自养等生物安全措施防控PCV3暴发流行.     

胞壁酰二肽对体外奶牛乳腺上皮细胞生长及胞内NOD2 mRNA表达的影响

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)除泌乳以外,还是奶牛乳腺的免疫屏障。本试验欲探究MDP对BMEC体外生长状态及胞内NOD2表达量的影响。【方法】选取健康泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺腺泡为组织原材料,采用胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离BMEC;使用上皮细胞特异性表达的角蛋白-18(cytokeratin-18,CK-18)及成纤维细胞特异性表达的波形蛋白(Vimentin)抗体,通过免疫荧光技术对纯化后获得的细胞进行鉴定;将BMEC设为6个处理组,分别添加浓度为0(空白对照组)、1、5、10、15及20μg·mL~(-1)的MDP,24 h后显微镜下观察细胞状态,同时提取细胞RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BMEC中NOD2的表达量。【结果】(1)胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离得到的细胞CK-18免疫荧光结果为阳性,而Vimentin反应为阴性;细胞生长状态良好。(2)空白对照组、1、5及10μg·mL~(-1) MDP刺激组的BMEC生长状态良好,无任何肉眼可见变化;15μg·mL~(-1) MDP刺激组可见少量的BMEC脱落;而20μg·mL~(-1)MDP刺激组可见大量BMEC脱落,漂浮,且即使仍贴壁的细胞,其形态也发生了变化。(3)与空白对照组相比,各刺激组细胞NOD2 mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,即刺激时间为24 h时,随着MDP浓度的增加,BMEC中NOD2受体mRNA的表达量逐渐增加(P0.05)。【结论】成功获得了纯度较好的BMEC,该细胞生长状态良好,可以用于后续试验;虽然BMEC中NOD2受体mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,但在保持BMEC生长状态正常的前提下,MDP体外刺激浓度应控制在10μg·mL~(-1)以下。这些结果提示我们:当病原菌入侵乳腺时,BMEC可以通过NOD2受体途径参与免疫防御反应,但这种防御能力受细菌数量或毒力强度的影响。即在一定的细菌数量或毒力范围内,随着细菌数量的增加或毒力的增强,奶牛乳腺的免疫防御反应也增强,进而清除外来病原菌;而当细菌数量或毒力强度超过一定范围时,乳腺组织受到严重损伤,免疫防御屏障也随之崩溃,奶牛乳腺局部甚至全身将呈现出明显的临床症状。