五重PCR检测转基因大豆的研究

随着转基因产品商品化,转基因植物、动物、微生物加工而成的转基因食品在传统食品市场中的份额在不断加大。然而,转基因食品中含有新的遗传物质,即外源DNA以及由外源基因鳊码的新蛋白,而传统食品是不存在这些情况的,并且传统食品经过人类几千年的食用证明是安全的。因此,转基因食品的安全性是摆在人类面前的重大难题。由于转基因食品的安全性在较短的时间内无法确定,因此,目前各国对转基因食品都采用标签制度进行管理,所以急需建立一套能够对转基因食品进行准确、快速检测的方法。文章的研究表明,五重PCR是一种可行有效的转基因大豆检测方法,具有广阔的应用前景。     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析#br#

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号：GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号：GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72 bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

河南省非洲猪瘟感染情况筛查

目的：对河南省猪瘟（CSF）流行区的猪群进行非洲猪瘟（ASF）感染的排查;方法：利用猪瘟抗原捕获ELISA试剂盒对27个猪场的猪瘟疑似病料进行CSFV鉴定,并用区别猪瘟强弱毒的RT-PCR检测方法鉴定猪瘟疑似病料。与此同时针对ASFV VP73蛋白基因设计一对引物利用PCR方法对ASFV进行排查;结果：河南省CSFV流行区没有ASFV的感染;且RT-PCR对CSFV的检出率高于ELISA ,两者差异显著。结果表明,尽管目前中国作为俄罗斯的邻国存在ASFV的威胁,但中国河南仍没有ASFV感染。     

苹果属观赏海棠McCHS基因的克隆及实时定量表达

以苹果属观赏海棠‘王族’品种叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1529bp的查尔酮合成酶(Chalcone sythase,CHS)基因的cDNA序列,其基因编码区共1167bp,编码389个氨基酸,命名为McCHS。使用实时荧光定量PCR和紫外可见光分光光度计,对3类不同叶色的观赏海棠品种‘火焰’(Malus‘Flame’,叶片绿色)、‘绚丽’(Malus ‘Radiant’,新叶红色)、‘高原之火’(Malus ‘Prairifire’,新叶红色)和王族(Malus ‘Royalty’,叶片紫色)幼叶和功能叶中的McCHS表达及其花色苷含量进行测定分析,结果表明:McCHS在4个品种的幼叶和功能叶中均有表达,其幼叶表达量的变化与叶片中花色苷含量的变化一致;除‘绚丽’外的功能叶表达量变化和花色苷含量变化也一致,‘绚丽’功能叶的特殊情况可能涉及花色苷合成途径中的其他酶和转录因子。     

Somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation of Japanese apricot (Prunus mume) using immature cotyledons

This study describes a successful method of somatic embryogenesis and genetic transformation using immature cotyledons of Prunus mume. Immature cotyledons from four different developmental stages of eight different P. mume cultivars were used for the experiments to optimize somatic embryogenesis and genetic transformation protocols. Somatic embryogenesis was induced when the explants were cultured on somatic embryo inducing medium consisting of MS basic medium supplemented with 1 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 1 μM 6-benzyladenine (BA). They were cultured for 30 days and then transferred to somatic embryo propagation medium containing 0.1 μM α-naphthaleneacetic acid (NAA) and 5 μM BA. It appeared that the developmental stage of the immature cotyledons used as explants was the most important factor for somatic embryogenesis; higher frequencies of somatic embryogenesis were observed when the immature cotyledons were less than 5 mm in length regardless of cultivars. For genetic transformation, the immature cotyledons were inoculated with Agrobacterium tumefaciens EHA101 harbouring a binary plasmid vector with neomycin phosphotransferase II and an intron-interrupted β-glucuronidase gene under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter, and three transgenic plant lines were obtained from inoculated “Sirakaga” immature cotyledons. Transgenic somatic embryos and shoots were selected using 25 mg l⁻¹ kanamycin. Integration of transgenes in the genome of GUS-positive putative transgenic shoots was confirmed by PCR and Southern blot analyses.     

Expression of chalcone synthase and chalcone isomerase genes and accumulation of corresponding flavonoids during fruit maturation of Guoqing No. 4 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow)

Chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase (CHI) are two key genes involved in flavonoid biosynthesis. They were both cloned from Guoqing No. 4 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow), and their relative expression and accumulation of corresponding flavonoid components during fruit maturation were investigated by real-time PCR and HPLC techniques, respectively. During fruit maturation, expression of CHS and CHI genes declined gradually in peels, as well as the concentrations of total flavonoids, trans-chalcone, narirutin and hesperidin; in pulps, however, expression of both genes showed an approximately uptrend, and the concentrations of total flavonoids and those three components were detected in a lower level without significant changes among different developmental periods (P < 0.05). This research confirmed that expression of CHS and CHI genes was positively correlated with flavonoid accumulation and overexpression of them could be a potential approach to produce massive desired flavonoids in citrus fruits.     

南瓜肌醇单磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆与表达分析

以中国南瓜（Cucurbita moschata）为试验材料,利用同源克隆和南瓜转录组unigene序列获得2个IMP基因的全长cDNA序列,将两个基因命名为CmIMP1和CmIMP2,GenBank登录号为KP735607和KP735608。CmIMP1基因cDNA全长1 053 bp,包含1个810 bp的ORF,共编码269个氨基酸;CmIMP2基因cDNA全长945 bp,包含1个807 bp的ORF,共编码268个氨基酸。序列分析发现两个基因均含有磷酸酶家族锂敏感的3个特殊结构域,系统进化树分析表明这2个南瓜CmIMP与其他植物IMP有较高同源性（63.8% ~ 94.0%）,并与葫芦科作物最接近。采用荧光定量PCR研究CmIMP在各组织及逆境条件下的表达模式显示,其表达具有组织特异性,在叶中表达最高,须和幼果次之;盐胁迫和干旱胁迫可强烈诱导CmIMP表达,ABA对CmIMP的诱导较微弱,推测CmIMP在南瓜响应非生物胁迫的分子调控机制方面发挥重要作用。     

国外引进甘蔗材料白叶病植原体巢式PCR检测及其序列分析

为有效防止引起重要危险性检疫病害甘蔗白叶病(SCWL)的植原体病原随引进甘蔗材料侵入我国,确保我国甘蔗生产安全,本研究对从缅甸、菲律宾、法国和泰国引进的22个甘蔗材料进行了SCWL植原体巢式PCR检测,并对阳性样品的巢式PCR产物进行了测序及序列分析。结果表明,18个甘蔗材料呈SCWL植原体阳性,阳性检出率为81.8%。所有SCWL阳性样品的16S-23S基因间隔区片段长210bp,与GenBank中已有的其他SCWL植原体分离物(登录号HQ917068、AB646271)的同源性为99.8%~100%,并在系统发育树中聚为一个类群。根据SCWL的巢氏PCR检测及其序列分析结果,对呈阳性的材料及时进行了集中销毁处理。     

马铃薯X病毒荧光定量PCR检测体系的建立及应用

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是危害茄科作物的一种重要病毒,为了建立特异性检测PVX的实时荧光定量PCR体系,本研究以PVX-1985分离物中外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列为模板,设计引物构建重组质粒并选择扩增效率高、特异性强的引物成功构建出标准曲线。利用建立的体系,成功检测到以含pCaPVX440侵染性克隆载体的农杆菌C58C1接种后的本氏烟(Nicotiana benthamiana)中PVX病毒RNA的拷贝数。     

烟粉虱MED隐种蜕皮激素受体基因cDNA克隆、转录与组织表达

蜕皮激素受体(ecdysone receptor,Ec R)是调控昆虫蜕皮、变态和生殖等过程中基因表达的重要调控因子。为研究Ec R在烟粉虱Bemisia tabaci生长发育中的作用,利用RT-PCR和RACE等技术扩增了烟粉虱MED隐种Ec R基因的c DNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在烟粉虱不同发育时期相对表达量的变化。Bt Ec R c DNA序列全长2 844 bp,含有一个1 518 bp的开放阅读框,共编码505个氨基酸,预测蛋白分子量为56 k D,等电点为6.43,含有特殊结构功能域:DNA结合域(DBD_Ec R)和配体结合域(LBD_Ec R),该序列编码的蛋白质序列与其它已报道的昆虫Ec R蛋白序列具有很高的相似性,命名为Bt Ec R(Gen Bank登录号:KR534774)。Bt Ec R在MED隐种若虫、雌成虫各发育时期均有表达,若虫期在伪蛹前期达到最高值,成虫期呈现先升高后降低的趋势,且在羽化后第7天达到最高值,约为羽化第1天的23倍。研究结果为揭示Bt Ec R在烟粉虱整个生长发育过程中的作用提供了重要依据。