南瓜基因CmNAC的克隆与序列分析(英文)

[目的]克隆南瓜基因CmNAC并进行序列分析。[方法]以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC和辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析。[结果]所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC;该基因片段具有其它植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。[结论]实验拟在南瓜中获得和抗逆性相关的NAC基因,为进一步研究该基因的生物学功能和植物基因工程奠定理论基础。     

Dithiocarbamate fungicide zineb induces oxidative stress and apoptosis in Chinese hamster lung fibroblasts

Dithiocarbamate fungicide zineb leads to disturbances in many cellular processes in Chinese hamster fibroblasts (V79 cells). We observed high apoptotic activity and oxidative stress induced in vitro by exposure of V79 cells to zineb demonstrated by statistically significant increase in lipid peroxidation (measured as TBARS - thiobarbituric acid reactive substances) as well as disturbances in glutathione homeostasis. Zineb also inhibited activity of topoisomerase I. Zineb did not show any effect on protein oxidation (measured by protein carbonyls content). N-acetyl-l-cysteine (NAC) suppressed cellular changes induced by this fungicide in V79 cells. NAC pre-treatment prevented TBARS production and significantly decreased the number of apoptotic cells induced by zineb. These results show that zineb can disturb many cellular processes via oxidative damage.     

刚毛柽柳NAC24基因的表达及抗逆功能分析

【目的】NAC类转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育过程,并在植物响应盐、干旱等多种非生物胁迫的过程中发挥至关重要的调控作用。本研究拟从盐生木本植物刚毛柽柳中克隆获得一个NAC转录因子基因,研究该基因的耐盐、抗旱功能,以期为研究木本植物NAC转录因子的抗逆分子机制奠定理论基础。【方法】在刚毛柽柳NaHCO_3胁迫转录组数据库中筛选获得一个NAC转录因子基因,将其命名为ThNAC24(GenBank登陆号:KF031949)。利用生物信息学工具将其与其他9个物种的NAC蛋白进行多序列比对,与拟南芥105个NAC蛋白进行进化树分析。分别用300 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1甘露醇对刚毛柽柳进行胁迫,在胁迫6、12、24和48 h后分别取刚毛柽柳根及叶组织。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析盐、干旱胁迫下ThNAC24基因在不同胁迫时间点及不同组织的表达情况,初步鉴定其是否响应盐、干旱胁迫。为进一步研究ThNAC24基因的抗逆功能,分别构建植物过表达(pROKⅡ-ThNAC24)及抑制表达(pFGC5941-ThNAC24)载体。利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系获得ThNAC24基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE)及对照(Control)刚毛柽柳植株。在盐、干旱胁迫下分析比较了ThNAC24基因瞬时过表达、抑制表达及对照刚毛柽柳植株的二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色情况,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,及电解质渗透率、失水率及丙二醛(MDA)含量,鉴定ThNAC24基因的耐盐、抗旱功能。【结果】ThNAC24基因的开放阅读框为1 023 bp,编码340个氨基酸。多序列比对结果显示ThNAC24在N端的氨基酸序列相似度比较高,具有NAC家族的序列特征;系统进化树分析结果显示ThNAC24与ANAC103和ANAC082的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:盐胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫12 h表达量最高,而叶组织中胁迫24 h的表达量最高;干旱胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫6 h表达量最高,在叶组织中胁迫12 h的表达量最高。ThNAC24基因在刚毛柽柳根和叶组织中均有表达且响应盐和干旱胁迫。过表达ThNAC24基因显著降低了刚毛柽柳H_2O_2和超氧阴离子含量,增强了POD和SOD酶的活性,从而减少活性氧(ROS)的积累。过表达ThNAC24基因能够降低刚毛柽柳在逆境胁迫下的电解质渗透率、失水率及MDA的积累,从而保护细胞膜结构的完整性。【结论】刚毛柽柳ThNAC24基因能够响应盐、干旱胁迫,过表达ThNAC24基因植株通过增强POD和SOD活性,进而提高ROS清除能力,减少细胞受损或死亡,从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。     

桃NAC基因家族生物信息学分析

NAC基因家族是最大的植物特有的转录因子家族之一,因在植物发育和逆境应答过程中起着多样的作用而被广泛关注。为进一步进行桃NAC家族基因鉴定、功能分析等研究提供基础信息,采用生物信息学方法预测了桃NAC基因家族成员数目、在基因组骨架上分布、表达模式、假定蛋白质结构和亚族分类。预测结果显示桃NAC基因家族包含115个假定NAC蛋白质,被分为17个亚族,且与拟南芥中NAC家族基因具有一定的相似性;1个NAC基因分布在11号骨架上,其余分布在1～8号基因组骨架上;对一级结构的分析结果显示桃NAC家族蛋白质分子量和氨基酸数目成正相关,绝大多数是亲水氨基酸,各亚族间等电点没有规律;115个蛋白质的二级结构全部以无规则卷曲为主要构成元件,且它们的三级结构大部分相似。在果皮中表达的NAC家族基因数最多,达到75%;在花芽中表达的NAC家族基因数较少,为1%。     

高粱SbNAC1基因克隆及初步分析

【目的】在植物抗逆信号转导途径中,NAC转录因子处于承上启下的关键位置,通过调控靶基因的表达发挥抗逆功能。本研究克隆高粱SbNAC1基因全长cDNA,并对其进行序列比对、进化分析,为深入研究其在作物抗逆反应中的生物学功能奠定基础。【方法】RT-PCR扩增SbNAC1全长cDNA,并对其进行基因序列比对和系统进化分析等生物信息学分析。【结果】SbNAC1cDNA全长966bp,编码321个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明高粱SbNAC1与水稻SNAC1同源性达到83.69%。     

谷子转录因子SiNAC18通过ABA信号途径正向调控干旱条件下的种子萌发

【目的】谷子(Setaria italica L.)具有显著耐旱性。研究旨在通过反向遗传学方法分析并鉴定在干旱条件下影响植物萌发过程的重要调控因子,为研究作物干旱条件下种子萌发的调控机制创造条件。【方法】使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子SiNAC18蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;利用real-time PCR方法检测SiNAC18在不同胁迫条件下的表达模式;通过瞬时转化的方法分析SiNAC18蛋白亚细胞定位;在拟南芥中过表达SiNAC18,分析SiNAC18的生物学功能;分析SiNAC18在转基因拟南芥中可能控制的下游基因。【结果】SiNAC18全长1 074 bp,编码由357个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为38.8 k D;系统进化树分析表明SiNAC18属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,与拟南芥基因At NAC29同源性最高;氨基酸序列比对结果显示,SiNAC18与其他物种包括水稻、拟南芥、大豆和玉米中同源性最高的NAC类转录因子蛋白的N端都具有A、B、C、D和E这5个保守结构域,蛋白C端具有高度多态性,证明SiNAC18的N端序列与其结合下游基因启动子元件相关;real-time PCR结果显示,SiNAC18在干旱(PEG)、ABA、高盐(Na Cl)及过氧化氢(H2O2)处理条件下的表达量明显上升;亚细胞定位结果表明SiNAC18蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在ABA和PEG胁迫处理下,SiNAC18转基因拟南芥与野生型种子的萌发率存在明显差异:在正常生长条件下,野生型拟南芥WT和SiNAC18转基因拟南芥的萌发率基本一致,在PEG浓度为10%和15%的MS培养基上,SiNAC18转基因拟南芥的萌发率显著高于WT。在2和5μmol·L-1 ABA处理条件下,转基因拟南芥的萌发率显著低于WT;下游基因表达分析结果显示,ABA信号途径相关基因At RD29A,脯氨酸合成相关基因At P5CR和At PRODH以及过氧化物酶基因At PRX34在SiNAC18转基因株系中的表达量高于WT中的表达量,表明SiNAC18通过调控这些下游基因影响转基因植物在干旱条件下的萌发率。【结论】谷子NAC类转录因子基因SiNAC18可能通过ABA信号途径、氧化胁迫调控等途径正向调控植物在干旱条件下的萌发过程。     

‘云香’水仙NAC基因克隆及表达分析

从‘云香’水仙转录组文库中筛选出1条NAC基因序列,采用PCR技术克隆得到其c DNA序列。序列分析表明,该NAC基因包含822 bp的开放阅读框,编码273个氨基酸,分子量30 903.9 u,命名为Nt NAC3153(Gen Bank登录号:KU375569)。理化性质分析和多重序列比对显示,Nt NAC3153蛋白是一个无跨膜区域的亲水性蛋白,在N端具有一段保守结构域。系统进化树分析表明,Nt NAC3153与同为单子叶植物的小果野芭蕉Ma NAC、二穗短柄草Bd NAC和小米Si NAC亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,Nt NAC3153基因能够被ABA、盐胁迫和高温诱导表达。研究表明:Nt NAC3153可能参与‘云香’水仙的抗逆调控机制。     

花生转录因子基因NAC4的等位变异分析

NAC转录因子在植物应答非生物胁迫中起重要作用。利用生物信息学分析推测花生栽培种转录因子基因Ah NAC4(登录号为HM776131.1)属于抗旱相关转录因子基因,对比栽培品种山花11号Ah NAC4的2条c DNA序列(Shr NAC4-a和Shr NAC4-b)及其相应的DNA序列(Sh NAC4-a和Sh NAC4-b)表明,Ah NAC4全长为1244 bp,编码区长度为1050 bp,含有2个内含子,分别位于182~279 bp和547~642 bp处,编码蛋白包含349个氨基酸。从抗旱性不同的32个栽培品种分离得到4类Ah NAC4,分别命名为Ah NAC4-a1、Ah NAC4-a2、Ah NAC4-b1和Ah NAC4-b2,缩写为a1、a2、b1和b2。a1和a2为等位基因,二者在717 bp处存在1个碱基差异,引起第174位氨基酸的改变,b1和b2为等位基因,二者存在14个SNP位点,其中717 bp和924 bp处碱基的差异引起第174位和第244位氨基酸的改变。供试品种中基因型为a1a1b1b1、a1a1b2b2、a2a2b1b1、a2a2b2b2的品种数分别为10、5、15和2。从19个野生种中分离得到11类NAC4的DNA序列(Aw1NAC4–Aw11NAC4),Aw1NAC4与栽培种b1、b2的核苷酸序列同源性最高,Aw2NAC4与栽培种a1、a2核苷酸序列同源性最高。推测栽培种a1基因编码蛋白对花生抵御干旱起关键作用,a1和b1基因编码蛋白的功能与野生种更接近。     

桃NAC家族基因生物信息学分析及其响应低温胁迫的表达特征

NAC(NAM-ATAF1/2-CUC2)是植物特有的具有多种生物功能的一类重要转录因子,在植物应对非生物胁迫、激素信号应答与器官形成中发挥重要作用。为了解桃NAC蛋白(PpNAC)及其在桃低温胁迫过程中的响应,采用生物信息学方法和qRT-PCR系统分析了桃NAC家族基因的成员、结构、功能和低温胁迫下的表达。结果表明,桃NAC家族共有119个成员,命名为PpNAC001~PpNAC119。PpNACs的氨基酸长度在68~862 aa,平均氨基酸长度为352 aa,分子量为7.2~96.1ku,等电点为4.3~9.5。除PpNAC119定位在染色体骨架上之外,其余基因均定位在桃的8条染色体上。基因结构和保守基序分析表明,位于同一亚族的成员基因结构相似,外显子数量和长度基本相同,并且同一亚族中的成员所含motif的种类和排列顺序基本相似,推测同一亚族的成员可能具有相同的功能,而不同亚族之间的差异可能与他们的功能特异性有关。对PpNACs蛋白启动子区2 000 bp的序列进行顺式作用元件分析,结果表明,脱落酸响应原件、光响应原件、茉莉酸甲酯响应原件、赤霉素响应原件、低温响应原件和生长素响应原件在筛选到的所有原件中占比较大。qRT-PCR结果显示,在4 ℃低温胁迫2、6 h,部分基因表达量上调不明显;低温胁迫12 h,16个NAC基因的表达量均显著上调。