新麦草YUCCA基因克隆及其表达特性分析

【目的】克隆新麦草分蘖关键基因YUCCA并明确其表达特性,为该基因功能验证和育种利用奠定基础。【方法】以不同分蘖类型的新麦草分蘖节为材料,采用PCR法克隆新麦草YUCCA基因并进行同源序列比对,构建1300-cYFP-YUCCA过表达载体,利用烟草瞬时转染及蛋白质印迹法分析新麦草YUCCA蛋白的表达位置及表达情况,通过RNA-Seq数据及qRT-PCR分析验证YUCCA基因的相对表达量。【结果】成功克隆了新麦草YUCCA基因全长,大小为1 336 bp,最大阅读框为1 236 bp,并成功构建了1300-cYFP-YUCCA过表达载体。多序列比对结果显示,新麦草YUCCA主要与麦类作物的亲缘关系较近。表达特性分析发现,YUCCA基因在多分蘖型新麦草中的相对表达量远低于少分蘖型新麦草;与叶、根等组织相比,YUCCA基因在分蘖节中的相对表达量最高。烟草瞬时转化和蛋白质印迹法分析均显示,YUCCA蛋白可以正常表达,其亚细胞定位于细胞质中。【结论】YUCCA基因在调控新麦草分蘖中起下调作用,可用于后续YUCCA基因功能的研究。     

基于基因编辑技术创制高亚油酸水稻材料

【目的】亚油酸是一种人体必需的脂肪酸,能加快体内脂肪代谢与分解、减少胆固醇在血管壁上形成积存、有效预防动脉硬化的发生、提高人体免疫力、促进骨骼发育、提高记忆力、预防脑部功能退化等功能。利用基因编辑技术对控制脂肪酸合成途径的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因进行精准编辑,关闭下游产物的合成途径,以便提高水稻上游亚油酸的含量,为创制富集亚油酸水稻材料提供依据。【方法】水稻脂肪酸合成途径中的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因(OsFAD3)存在2个拷贝,分别分布在第11和第12染色体,且两者cDNA同源性达97.32%。根据基因编辑原理(编辑的特异性取决于引导RNA(gRNA)的特性),在2个同源基因序列高度一致的外显子区域,分别设计合成2个gRNA,并分别构建植物基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化本地受体材料(富源4号)。通过对基因编辑植株进行靶位点测序鉴定,分析2个位点的编辑效率和基因型。同时,对OsFAD3双突变体进行粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状分析。采用气质联用检测法测量OsFAD3双突变体籽粒的37种脂肪酸含量。【结果】获得2个位点的纯合编辑材料,同时也获得了其他不同基因型组合的编辑材料;...     

籼稻9311HR-T显性高秆基因的初步定位

从转入bar基因的籼稻半矮秆材料9311HR的BC3F2中发现了1株高秆突变体9311HR-T,其株高和秆长分别比野生型9311HR增加60.8%和71.5%,其高秆性状受1对显性基因控制.以9311HR-T与02428杂交产生的F2群体为材料,利用微卫星标记将9311HR-T高秆基因定位在水稻第1染色体长臂上的SSR标记RM472和RM1387之间,距RM472和 RM1387的遗传距离分别为8.6 cM和12.3 cM,该基因暂命名为DT1.     

四川地区猕猴桃病毒1的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

为了明确近期新西兰报道的侵染猕猴桃的新病毒——猕猴桃病毒1(Actinidia virus 1,AcV-1)在四川地区猕猴桃上的发生情况及其分子特性,采用RT-PCR对来自四川6个地区疑似感染病毒的90份猕猴桃主栽品种‘红阳’和‘金果’的叶片样品进行检测。结果表明,22份样品为AcV-1阳性,检出率为24.4%。将获得的5个AcV-1分离物和已报道的新西兰分离物K75的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因序列进行比对,结果表明,分离物间核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为84.8%～97.1%和89.7%～99.6%,其中除邛崃分离物HYH5与新西兰分离物K75的核苷酸序列相似性较高(97.1%)外,其余4个分离物均低于91%。系统进化分析结果显示,这些分离物主要聚集在3个分支上,分离物HYH5与新西兰分离物K75位于同一分支,其余分离物位于另外2个分支。     

枸杞Lb＿PPR1的克隆及其在不同育性品种中的表达分析

三角状五肽重复(Pentatricopeptide repeats,PPR)蛋白定位于多种细胞器中,参与细胞核和细胞器中特异单链RNA的转录后修饰和编辑,在植物生长发育的多个阶段均发挥着重要的作用。分别从枸杞(Lycium barbarum)雄性可育系‘宁杞1号’和不育系‘宁杞5号’中克隆了Lb_PPR1基因,并对其编码蛋白质进行理化性质、亚细胞定位、保守结构域、蛋白结构以及系统进化等方面进行预测分析。结果显示,‘宁杞1号’和‘宁杞5号’中Lb_PPR1基因的开放阅读框均为1 977 bp,编码658个氨基酸,但其中存在20个碱基和14个氨基酸的差异。Lb_PPR1蛋白包含14个串联重复的PPR保守基序,属于PLS家族,该蛋白定位在细胞膜和细胞质。二级、三级结构预测显示该蛋白以α螺旋为主。同源进化分析得出Lb_PPR1蛋白与同属茄科的辣椒和烟草PPR蛋白亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR检测Lb_PPR1在枸杞不同组织器官及不同发育阶段花药中的表达特性。结果显示,Lb_P     

卷丹转基因体系构建及岷江百合LrCCoAOMT的导入

以卷丹(Lilium lancifolium Thunb.)无菌小鳞片为试材,通过切片处理、优化农杆菌侵染浓度与时间以及重悬液和共培养基成分,构建农杆菌介导的高效遗传转化体系。结果表明,MS+1.5 mg·L^-16-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+30 g·L^-1蔗糖是切片芽分化的最佳培养基,添加100 mg·L^-1抗坏血酸能有效抑制褐化并促进不定芽增殖。MS+2.0 mg·L^-1 NAA+30 g·L^-1蔗糖是生根诱导的最佳培养基。抗生素敏感性测试发现,培养基中添加Kan 100 mg·L^-1或Hyg 75 mg·L^-1结合Cef 400 mg·L^-1适宜抗性筛选。GUS染色分析表明,以去除大量元素的改良MS+100μmol·L^-1AS和去除大量元素的改良MS+1.0mg·L^-16-BA+1.0mg·L^-1NAA+100...     

芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’(Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’)通用调节因子14-3-3基因cDNA序列,命名为Br14-3-3(GenBank登录号为MK896872)。该基因全长1 113 bp,开放阅读框全长774 bp,编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达,结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高,幼苗中次之;低温抑制了Br14-3-3的表达,其他非生物胁迫可诱导该基因表达,暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2(Enhanced disease resistance2),在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1,构建CRISPR/Cas9敲除载体,通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序,结果表明,共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变,编辑效率为32%;突变体植株生长势较弱,叶片较小,茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测,结果表明,接种葡萄白粉菌(Erysiphe necator Schw.)5d后,突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝,表皮细胞产生大量明显的H2O2,而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器,无明显H2O2产生。这些结果表明,可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2,提高葡萄白粉菌抗性。     

罗氏沼虾细胞色素P450家族CYP302a1基因克隆及其在蜕皮周期中的表达

蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1 859 bp,开放阅读框(ORF)为1 629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a...     

饲料中维生素A对青鱼幼鱼生长、血清生化指标和肝脏糖脂代谢酶活性及基因表达的影响

为研究饲料中维生素A(VA)对青鱼幼鱼生长、血清生化指标和肝脏糖脂代谢相关酶活性及基因表达的影响,实验选取360尾初始体质量为(6.10±0.10) g的青鱼幼鱼,随机分配至3个实验组中,每个实验组设置3个平行。采用单因素实验设计,以无维酪蛋白和明胶为蛋白源、菜籽油为脂肪源、糊精为糖源,同时添加矿物质混合物和维生素混合物(无VA添加)配制成3组实验饲料,分别以饲料1 (Diet1)、饲料2 (Diet2)和饲料3 (Diet3)表示。在饲料1、饲料2和饲料3中分别添加0、2 200和20 000 IU/kg VA醋酸酯(500 000IU/g),经高效液相色谱法(Agilent-1100, Agilent,美国)检测后实验饲料中VA的实际含量分别为178.2、2 058.9和18 436.2 IU/kg,养殖周期为8周。结果显示:饲料中VA缺乏会显著降低青鱼幼鱼的增重率(WGR)和特定生长率(SGR);VA缺乏会显著降低血清血糖(GLU)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)浓度,增加总胆固醇(TCH)浓度。饲料中添加2 058.9IU/kg VA能显著提高肝脏己糖激酶(HK)、磷...