柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用

柑橘黄龙病是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害,在我国大部分柑橘产区发生,严重制约了我国柑橘产业的发展。本文根据黄龙病病原物亚洲韧皮杆菌核糖体16SrRNA基因设计了1对PCR引物HLBF468/HLBR877,并以此为基础建立了常规PCR反应体系,确定了检测体系的特异性和灵敏度。结果表明该体系的检测灵敏度比先前报道的常规PCR方法有了明显提高。利用建立的PCR体系完成了对广东和广西两省区果园柑橘黄龙病的抽样检测。本研究建立的常规PCR方法可以作为一种简便、准确、灵敏的检测技术应用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

对柑橘黄龙病防控对策的再思考

柑橘黄龙病系柑橘产业的头号杀手,该文分析其流行态势和防控形势,概述其研发主要进展,并分析思考了当前防控对策、面临的困窘和改进建议。     

手持式柑橘除梢机的设计与试验

针对目前柑橘人工除梢劳动强度大、效率低及反复性大等问题,通过分析柑橘新梢物理特性和生长环境,设计了一种手持式柑橘除梢机;阐述了该除梢机结构及工作原理,并对锯片和无刷电机等关键部件及切割线速度等工作参数进行了设计与试验。试验结果表明:该除梢机的除梢成功率为93.8%,除梢后留茬长度理想率为88.4%;该机最大工作高度达3.1m,整机能连续工作12h以上。     

土霉素处理对柑橘黄龙病的防治效果及PP2基因表达的影响

【目的】评价土霉素(oxytetracycline,OTC)药剂对不同发病程度柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）的防治效果,并检测OTC处理后韧皮部关键基因——韧皮部蛋白2（PP2）的表达量变化,为HLB的有效防控提供科学依据,也为OTC作用机理研究提供参考。【方法】应用可有效抑制、杀死病原菌的OTC,树干定量注射0.1 g/树于不同发病程度HLB（初感染、轻度发病和重度发病3组）的4年生Valencia夏橙,注射后7、30、60、90 d定期采集Valencia叶片样品监测HLB致病菌Cadidatus Liberibacter asiaticus(Las)含量、淀粉含量及PP2基因表达量变化。树干注射OTC后90 d采集不同处理Valencia的嫩叶、成熟叶片及茎,进行淀粉染色光学显微观察（LM）,直观反映植株累积淀粉的变化。树干注射OTC后80 d调查柑橘嫩叶抽发的情况,综合一系列指标评价OTC对HLB的防治效果。【结果】注射OTC 0.1 g/树对初感染HLB的4年生Valencia植株治疗作用最明显,7 d后检测即为阴性,并可保持90 d,其成熟叶片的淀粉含量明显减少,但茎内仍有淀粉粒富集;轻度发病夏橙注射90 d后叶片内的Las含量从（1.68×10 ⁶±858884）cells/g叶片减至（7.21×10 ⁴±30981）cells/g叶片,下降幅度极为明显,其成熟叶片内的淀粉含量在90 d内一直呈下降趋势;重度发病植株注射后叶片内的Las含量从（4.10×10 ⁸±3.04×10 ⁸）cells/g叶片减至（2.80×10 ⁷±2.70×10 ⁷）cells/g叶片,但从数量而言仍然有较多分布,除了新长出的秋梢,其成熟叶及茎内的淀粉粒含量仍旧很大,说明0.1 g/株OTC不足以治愈4年生重度发病Valencia夏橙。对PP2基因表达分析结果显示,注射OTC后30 d,Valencia夏橙体内的PP2基因表达量大幅度下降,随后90 d内表达量稳定,与注射后30 d的表达量较为一致。 【结论】OTC可以用于HLB的防控,对初感染（Las含量为<9.00×10 ⁵cells/g叶片）及轻度发病（Las含量为9.00×10 ⁵—9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的柑橘植株治疗作用较好,不适用于重度发病植株（Las含量为>9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的治疗。注射OTC后,PP2基因表达量下降明显,说明OTC可有效减少韧皮部病菌等的胁迫压力。     

柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布格局与参数特征应用研究

为了揭示浙江柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布信息和染病特征,2017—2018年对7个柑橘黄龙病发生样地2 900株橘树进行黄龙病菌PCR检测,按10株1样方取得290组样本资料,应用聚集度指标法对其空间分布型进行数据测定,结果达到C>1、I>0、K>0、C_A>0、M^*/$\bar{x}为了揭示浙江柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布信息和染病特征,2017—2018年对7个柑橘黄龙病发生样地2 900株橘树进行黄龙病菌PCR检测,按10株1样方取得290组样本资料,应用聚集度指标法对其空间分布型进行数据测定,结果达到C1、I0、K0、C_A0、■,均为聚集分布格局,表明柑橘黄龙病菌PCR阳性病株田间分布趋向聚集分布。经Iwao的M~*-线性模型回归检验表明,柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布的基本成分是个体群,病株间相互吸引,表现有明显的发病中心;经Taylor的■幂法则模型检验分析表明,黄龙病菌阳性病株的空间分布具有密度依赖性,阳性病株密度越高越趋向聚集分布,即聚集强度随阳性率上升而增强。其理论抽样数模型为■及序贯抽样公式为T_n=1.6976/[D■+0.9296/n]。应用这些参数特征对提高田间柑橘黄龙病早期预警效率和决策防控具有良好的指导意义。     

基于无人机高光谱遥感的柑橘黄龙病植株的监测与分类

柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是柑橘产业的毁灭性病害,及早发现并挖除病株是防治HLB的有效手段。通过无人机低空遥感监测大面积果园,可大大减少HLB排查工作量和劳动力。该文获取了无人机低空柑橘果园的高光谱影像,分别提取并计算健康和感染HLB植株冠层的感兴趣区域的平均光谱,并对初始光谱进行Savitzky-Golay平滑、异常数据剔除和光谱变换,得到原始光谱、一阶导数光谱和反对数光谱3种光谱,对这3种光谱采用主成分分析法进行降维,与全波段信息比较,分别采用k近邻(kNN)和支持向量机(SVM)进行建模和分类。结果表明,以二次核SVM判别模型对全波段一阶导数光谱的分类准确率达到94.7%,对测试集的误判率为3.36%。表明低空高光谱遥感监测HLB的手段具有可行性,可大大提高果园管理效率和政府防控病情力度。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。     

正常管理果园柑桔木虱种群数量年消长规律调查及与次年黄龙病发生率的相关性分析

柑桔木虱没有得到有效控制是正常管理柑桔园黄龙病发生严重的最重要原因,弄清这些果园柑桔木虱种群的年发生规律是有效防治柑桔木虱和柑桔黄龙病的基础.6年的系统调查结果表明,10～12月份是木虱种群数量最多的时期,其次分别是9月、1月和5月.9～12月的柑桔木虱数量与次年的柑桔黄龙病发生率呈显著正相关.     

柑橘黄龙病菌LAMP检测制样方法的比较

分析比较适合大规模柑橘样品黄龙病LAMP检测的制样方法,为柑橘黄龙病的防治提供技术支持。分别采用CTAB-trion法、磁珠法、裂解法、浸提法四种制样方法提取病原菌核酸,利用LAMP和常规PCR进行扩增,并从制备步骤、简易程度、核酸质量、成本、耗时及环保等方面比较,确定最佳制样方法。CTAB-trion法和磁珠法提取的核酸质量最好,其OD260/OD280值在1.8-2.0之间,满足LAMP扩增要求,但操作步骤繁琐、困难,成本、耗时较高且CTAB-trion法需使用苯酚和氯仿试剂;裂解法提取的核酸质量虽不高,但可满足LAMP扩增,同时其操作步骤极少且易,成本低、耗时少,相对环保;浸提法提取的核酸量少、质量差,无法满足LAMP扩增要求。裂解法是柑橘黄龙病LAMP检测的最佳制样方法,与LAMP联用可建立成本小、操作简便、高效快速、环境友好、结果可视化、无需昂贵特殊仪器、适合大规模柑橘样品的黄龙病检测。