柑橘黄龙病菌亚洲种、虫媒及植物寄主互作研究进展

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)病原入侵寄主植物后不仅会对其代谢、激素调节、防卫反应等方面产生影响,同时,木虱获菌后,其发育、倾向性及内共生菌种群也会发生改变,病原还能通过改变寄主植物的挥发性信息物质等间接调控媒介昆虫行为。对黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)、虫媒及植物寄主互作相关研究进行综述,并对今后相关研究进行了展望,以期对柑橘黄龙病研究有所促进。     

Development of a sensitive and reliable droplet digital PCR assay for the detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus'

Citrus Huanglongbing(HLB, yellow shoot disease) is one of the most serious citrus diseases worldwide. To better improve the detection sensitivity, a droplet digital PCR(ddPCR) assay was developed for the rapid detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus'(Las), the putative causal agent of HLB. The detection of sensitivity comparison using positive plasmid indicated that dd PCR was superior to quantitative PCR(qPCR) for detecting and quantifying Las at low concentrations. The Las detection of 40 field samples also showed that six of 13 asymptomatic samples(46.15%) with high Ct value(35) were positive by dd PCR. This methodology showed great potential for early HLB infection diagnosis.     

仁化县贡柑主要病害的调查与检测

【目的】贡柑生产是广东省韶关市仁化县的支柱性产业之一。近年来,其种植面积逐渐扩大;2019年仁化县柑橘产业园入选为广东省第二批省级现代农业产业园。但关于该地区贡柑上主要病害的调查和研究还未见详细报道。【方法】通过QPCR(probe)和RT-PCR的方法分别对采集的150个样品进行贡柑黄龙病和病毒病(衰退病、碎叶病、裂皮病、黄脉病)的检测;除此之外,在田间调查时有些果园的真菌病害发病较重,因此采用常规的真菌分离方法并利用真菌的通用引物转录间隔区ITS对采集自该地区的病样进行主要病原菌的分离和分子生物学鉴定。【结果】2019年4月抽检样品的黄龙病平均阳性率为13.2%;10月除黄坑镇黄坑村的失管园外,抽检阳性率均在17%以下。值得注意的是,来自黄坑镇黄坑村的失管果园,柑橘黄龙病的阳性检出率从2019年4月的18.2%上升到10月的87.5%;丹霞街葛布村果园的阳性检出率则从6.7%上升到14.3%。同时,衰退病毒病的平均抽检阳性率4月为41.2%,10月为100%,其他病毒病均未检测到;柑橘溃疡病、柑橘炭疽病和柑橘褐斑病也有发生,个别果园发生较严重。【结论】仁化县贡柑黄龙病有一定程度的发生,可通过加强以田间管理为重点的优质高产可持续发展的分类防控等综合防治措施进行防控,尽量减轻黄龙病对柑橘产业的危害,延长柑橘园的丰产年限和生产寿命。但柑橘衰退病毒病的发病率较高,建议在种苗生产或种植前加强对贡柑衰退病毒病的检测;同时加强对该地区柑橘炭疽病和柑橘褐斑病等病害的科学防治,合理用药,减少化学农药用量。     

基于高光谱成像技术的柑橘黄龙病病情诊断及分类

【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种无法根治且易扩散的病害,建立柑橘黄龙病病情诊断及分类的方法,以及时发现并去除病株,防止感染其他果树。【方法】基于高光谱成像技术,利用最小噪声分离变换进行降维去噪、像元纯净指数获取纯净像元并建立训练集,通过Fisher判别法对柑橘黄龙病病情进行鉴别并分类。【结果】通过对训练集设置适当的门限值,柑橘黄龙病病情识别正确率达90%以上。【结论】利用高光谱技术进行柑橘黄龙病病情诊断具有较高的可行性。     

柑橘黄龙病疫情监测与防控技术研究

为了研究柑橘黄龙病传播介体种群消长规律和疫情动态,破解柑橘黄龙病防控问题,以主栽的早熟‘宫川’品种为重点在古城和大田柑橘园设立2个柑橘木虱监测点,采用定点定人定树定枝定时方法对柑橘木虱进行系统监测;以乡镇为单位每年在10-11月的果实显症期对全市柑橘园柑橘黄龙病进行全境式普查。结果表明,柑橘木虱季节性消长规律主要呈三峰型曲线变化,其峰期主要在6月下旬至7月下旬、8月中旬至9月中旬、10月上旬至11月上旬,其年度之间和果园之间总体趋势基本一致,但其峰值峰次差异却较大,主要受初见期、基数和气温等三要素影响所致,并建立柑橘木虱时序成若虫数量与其气温关系模型：D=0.018T+17.365（n=36,r=0.3563*）。针对柑橘木虱传播柑橘黄龙病的特征特性,摸索集成了“一挖两治”防控策略和“三防五关”防控技术。经过3年的全面应用,将柑橘黄龙病发病面积持续控制在5%以内,2008-2010年将加权平均株发病率分别控制在0.084%、0.077%、0.051%,基本达到了持续控制效果,保障了临海市柑橘产业持续健康发展。     

福建省柑橘黄龙病危害及其流行规律研究

 【目的】全面了解柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,简称HLB）在福建省的危害分布及其流行情况,有效指导HLB的防控。【方法】对全省48个县（市、区）及245个柑橘主产乡镇HLB虫媒柑橘木虱（Diaphorina citri）分布及HLB的危害进行调查,以PCR（polymerase chain reaction,PCR）方法对采集的斑驳黄化柑橘叶片、红鼻果进行确证性检测,分析HLB的危害流行规律,并应用滑动相关分析筛选影响HLB流行的气象要素。【结果】全省各县及柑橘主产乡镇均可查到柑橘木虱和HLB病株（最北N28°07′、海拔最高880 m）,HLB危害程度为平均发病率16.59%,主栽品种间感病性差异显著,排序为宽皮桔＞甜橙类＞柚类;HLB发病率与果园纬度、海拔、坡度呈显著负相关;在南亚热带气候区的长泰县（N24°07′）,HLB田间发病率仅与临近2年春季气候有关,推测HLB潜伏期为6～18个月,同时春梢期日照、幼果期湿度与HLB发病率呈极显著正、负相关,“春旱”为HLB流行性气候;柑橘红鼻果、斑驳黄化叶片的HLB病原Nested-PCR检出率分别为93.8％、73.1％,前者可靠性优于后者,二类症状均可视为HLB的典型症状。【结论】福建境内的柑橘产区均有HLB病原与柑橘木虱的分布。若春季遇严重干旱HLB就有局部爆发的可能。柑橘红鼻果可作HLB田间诊断依据。     

基于短串联重复和PAGE的柑橘黄龙病菌‘Candidatus Liberibacter asiaticus’种间遗传多样性分析

 韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Libriacter asiaticus’,‘Ca. L. asiaticus’)是目前流行范围最广、危害最严重的柑橘黄龙病致病菌。本研究利用‘Ca. L. asiaticus’基因组中全套串联重复基因(short tandem repeat, STR)开发了一套系统的方法用于‘Ca. L. asiaticus’遗传多样性和黄龙病分子流行学研究。PCR和PAGE分析筛选到的36个STR位点中,有33个获得了有效扩增。其中20对引物对不同来源的32个样品的扩增产物多态性较好,最多的可扩增出9种条带类型。采自我国6省的32个‘Ca. L. asiaticus’阳性样品之间的Shannon’s信息指数为0.14~1.90,平均为0.68;Nei’s基因多样性指数为0.06~0.81,平均为0.38,各省的菌株表现出较高的遗传多样性,特别是来自福建、广西和云南三省的。聚类分析发现可能为中国黄龙病发源地的广东省的黄龙病菌株具有一定的遗传特异性;其余邻省之间存在由木虱传播引起的菌株交流的可能性可以解释该病害在省际间传播。研究表明,开发的STR标记结合PAGE的方法可作为今后菌株遗传多样性和病害分子流行学分析的高效方法。     

正常管理果园柑桔木虱种群数量年消长规律调查及与次年黄龙病发生率的相关性分析

柑桔木虱没有得到有效控制是正常管理柑桔园黄龙病发生严重的最重要原因,弄清这些果园柑桔木虱种群的年发生规律是有效防治柑桔木虱和柑桔黄龙病的基础。6年的系统调查结果表明,10－12月份是木虱种群数量最多的时期,其次分别是9月、1月和5月。9－12月的柑桔木虱数量与次年的柑桔黄龙病发生率呈显著正相关。     

柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

浙江柑橘黄龙病病原β-操纵子核糖体蛋白基因的PCR检测及其序列比对

长期的观察发现,不同柑橘品种感染黄龙病后出现的病症也不尽相同,针对这种现象本文检测了浙江柑橘黄龙病病原β-操纵子核糖体蛋白基因并进行了序列比对,BLAST比对结果说明所扩增的基因序列之间差异性为0,与基因库(NCBI)中黄龙病亚洲韧皮杆菌DNA序列相似性为100％,由此说明浙江柑橘黄龙病病原β-操纵子核糖体蛋白基因并未发生变异,出现上述现象可能是其他基因发生变异或者与品种的抗病性有关。