灯盏乙素抑制热应激诱导猪肾小管上皮细胞凋亡研究

灯盏乙素(Scu)为灯盏花中提取的单一黄酮类化合物,具有清热解毒和保护细胞免受热应激损伤的作用。试验将不同浓度Suc培养的猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)在42℃下热应激1 h,采用RNA干扰法沉默细胞HSP72基因表达,荧光定量PCR和Western blot检测细胞热休克蛋白(HSP)70、Bcl-2、Bax、细胞色素C(Cyt-c)和caspase-3裂解。结果表明,Scu显著增加细胞Bcl-2蛋白和HSP70蛋白水平,增加Bcl-2/Bax比值,抑制Cyt-c的释放及pro-caspase-3裂解和caspase-3表达;但沉默HSP70后,细胞Cyt-c释放和caspase-3表达均显著增加。由此可知,Scu抑制LLC-PK1凋亡,保护细胞免受热应激损伤。     

白粉病菌侵染条件下小麦酵母双杂交文库的构建及可用性检测

为解析白粉病菌侵染小麦以及小麦防御的分子机制,以抗白粉病种质N9134为材料,剪取白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)接种48 h后的叶片,提取总RNA,利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA(ds-cDNA),并进行均一化处理和SfiI酶切处理,处理后的ds-cDNA分别连接pGADT7-SfiI三框载体,将连接产物转化至感受态细胞HST08中构建文库。通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集细菌并提取质粒。经鉴定,该文库库容量大于1.0×10~6 cfu·mL~(-1),插入片段主要分布在400～2 000 bp之间,重组率为100%,冗余度为3%。利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,获得2个与热休克蛋白HSP40-70互作的蛋白质,分别为DnaJ类蛋白(DnaJ-like)和E3泛素蛋白连接酶AIP2(AIP)。综上表明,文库构建质量较好,为后续筛选抗逆关键基因奠定了基础。     

小麦条锈菌hsp70基因的克隆及热胁迫下的表达特征分析

为明确热激蛋白70在小麦条锈菌对高温适应性中的作用,采用RACE和PCR技术扩增得到小麦条锈菌hsp70的基因全长,并利用实时荧光定量PCR技术对热胁迫下不同温度敏感类型小麦条锈菌中hsp70的表达特征进行分析。克隆得到的小麦条锈菌hsp70基因组序列全长为2 817bp,包含7个内含子,cDNA序列全长为2 267bp,其中开放阅读框为1 917bp,编码639个氨基酸,分子量为66.7ku,等电点为5.15。编码蛋白含3个保守的HSP70氨基酸序列。qRT-PCR试验结果表明,28℃热激后,hsp70的转录水平随热激时间的延长而略有增加,2h达到最高值。不同温度敏感类型菌株在热激2h后hsp70的相对表达量具有显著差异。低敏感类型菌株hsp70平均表达量为未经处理对照的7.12倍,而高敏感类型菌株hsp70平均表达量仅为对照的1.63倍。     

荷斯坦奶牛热休克蛋白70基因3＇-侧翼区遗传变异与耐热性的关系

本实验采用PCR-SSCP和测序技术对荷斯坦奶牛和鲁西黄牛两个群体共673个个体热休克蛋白70基因(HSP70)的3'-侧翼区的遗传变异,及该突变对奶牛产奶性状和耐热性状的影响进行研究.研究结果表明设计引物扩增片段大小500 bp,扩增产物具有多态性.供试的72头鲁西黄牛和601头荷斯坦奶牛均发现3种基因型,为从、AB和BB型.测序分析发现热休克蛋白70基因(HSP701的3'-侧翼区存在1个新突变,T→C.关联分析结果表明,BB基因型荷斯坦奶牛个体,乳脂率、乳蛋白率和305 d产奶量,相对于AA基因型的个体都要高;红细胞钾含量和产奶量下降率比AA类型个体要低,且达显著水平(P<0.05).鲁两黄牛B基因基因频率为74.31%,而荷斯坦奶牛B基因基因频率却比较低,为14.89%.由于鲁西黄牛耐热性显著强于荷斯坦奶牛,且耐热性最高的BB型奶牛产奶量下降率显著低于耐热性差的AA型奶牛.等位基因B可作为选育抗热应激奶牛潜在的分子遗传标记.     

牦牛HSP27基因的克隆及其在雌性生殖器官中的表达

【目的】克隆牦牛热休克蛋白27(heat shock proteins27,HSP27)基因,分析其生物学特性,研究正常生理条件下HSP27基因在母牦牛主要生殖器官中的表达差异。【方法】采取卵泡期后期、黄体期后期同侧的卵巢、输卵管和子宫,以及妊娠期早期（胚胎约长2.3cm）妊娠侧的卵巢、输卵管和子宫组织,以其cDNA为模板,利用RT-PCR扩增牦牛HSP27基因,并将纯化的PCR产物克隆到pMDTM18-T Vector 载体中进行测序;利用生物信息学软件对HSP27基因的特征进行生物信息学分析,预测功能结构域;采用实时荧光定量 RT-qPCR 测定繁殖周期母牦牛主要生殖器官中的相对表达量,用SPSS19.0软件对试验数据进行差异显著性分析。【结果】成功克隆出包含完整编码区的牦牛HSP27基因序列,其编码区长450bp（GenBank 登录号：KP716832）,可编码149个氨基酸,其中含量最高的是亮氨酸Leu（10.7%）,含量最低的是色氨酸Trp（0.7%）。HSP27编码区蛋白原子个数为2 366,分子式为C747H1189N205O220S5,分子量为16.722kD,理论等电点为5.33;HSP27编码蛋白为非跨膜可溶性蛋白。同源性分析显示,牦牛HSP27基因的核苷酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的核苷酸序列同源性分别为99.8%、98.4%、97.8%、97.6%、90.3%、89.7%、89.7%、86.7%、86.7%、85.5%和85.3%,牦牛HSP27基因的氨基酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的氨基酸序列同源性分别为100%、100%、100%、100%、96.3%、100%、96.8%、100%、100%、96.3%和96.3%;系统进化树表明,牦牛HSP27基因与家牛、印度水牛、绵羊和藏羚羊的进化水平较为相近,与灰狼、猩猩和人类的较远。RT-qPCR结果表明,牦牛HSP27基因在卵泡期、黄体期、妊娠期不同时期的卵巢、输卵管和子宫组织中均有表达,其中在卵泡期卵巢中的表达量最高,在黄体期子宫中的表达量最低;在不同繁殖周期,牦牛HSP27基因在卵巢中的表达均极显著大于在子宫中的表达,其在卵巢、输卵管和子宫的表达因妊娠而发生了显著变化。【结论】通过与其他物种HSP27基因的同源性对比分析,发现HSP27基因在进化中具有高度保守性,同时也存在种属特异性;通过对HSP27在繁殖周期母牦牛主要生殖器官中的表达情况分析,推测出HSP27可能参与了母牦牛妊娠的调控,为进一步探讨HSP27在牦牛生殖过程中发挥的作用提供了参考资料。     

沙葱萤叶甲热激蛋白基因GdHsp10a的克隆、分子特征与表达分析

为明确热激蛋白HSP10在沙葱萤叶甲Galeruca daurica生长发育过程中的作用,采用RTPCR及RACE技术克隆沙葱萤叶甲Hsp10基因cDNA的全长序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,并利用qPCR技术对该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段、成虫羽化后不同时期以及不同温度下的表达谱进行分析。结果表明,克隆获得1条新的沙葱萤叶甲Hsp10基因,命名为GdHsp10a,GenBank登录号为MG460308,cDNA序列全长为526 bp,开放阅读框为333 bp,编码蛋白含110个氨基酸,预测分子量为11.97 kD,等电点为9.74;无信号肽及跨膜结构。同源比对及系统进化分析表明,GdHSP10a与光肩星天牛Anoplophora glabripennis HSP10亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为53.15%。qPCR结果表明,GdHsp10a在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫期的表达量显著高于幼虫期、预蛹期及蛹期;成虫羽化后不同时期表达量差异显著,25 d时表达量最高,其次为100、10和7 d时的表达量;温度对GdHsp10a表达量有显著影响,30℃下表达量最高,35℃下表达量次之,15、20、25及40℃下表达量最低且无显著差异。表明GdHsp10a可能在沙葱萤叶甲生长发育及成虫越夏中起着多重作用。     

热休克蛋白70及其对精子影响作用的研究进展

分子伴侣是正常细胞和细胞损伤不同阶段蛋白质动态平衡的关键决定因素,热休克蛋白70(HSP70)是普遍存在的分子伴侣,具有多种细胞功能.伴侣蛋白通过利用各种独特的机制来维持细胞中正确的蛋白质折叠,以防止分子间的异常相互作用,防止蛋白质聚集以及蛋白质重折叠等,且HSP70在细胞中与辅助伴侣蛋白协同互作,这些辅助伴侣蛋白由J...     

热应激对小鼠囊胚中HSP72表达及对孵出率影响的研究

将体外培养的小鼠囊胚分别施以40℃和38℃热休克处理1h、2h和3h,然后在37℃条件下分别恢复3h、2h和1h后,利用Westernblot技术检测小鼠囊胚HSP72的表达,同时观察囊胚的热敏性,以明确热应激对小鼠囊胚中HSP72表达及对孵出率影响。结果显示,38℃及40℃热应激组均有HSP72的表达,38℃组2h达到最高水平,与对照组相比差异显著(P<0.05),然后表达量随热应激时间延长而降低;40℃组3h达到最高水平,与对照组相比差异不显著(P>0.05)。38℃及40℃热应激组囊胚孵出率均随着热应激时间的延长而降低。结果表明,轻度、短时间热应激既可使小鼠囊胚HSP72表达;热应激能够降低小鼠囊胚的孵出率。     

侵染广东番茄的番茄褪绿病毒分子鉴定

在广东番茄上发现一种新病害,病株表现为叶片褪绿,叶脉颜色变深及叶片增厚等症状。利用番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)HSP70基因的两对特异引物对番茄病样进行RT-PCR检测,结果表明,从所采集的6份病样中均扩增到预期大小的DNA特异片段。对其中1份样品的扩增片段进行克隆与序列分析,结果表明,扩增片段包括1个长度为1 665个核苷酸的完整病毒基因,其核苷酸序列与已报道的ToCV HSP70基因有较高的同源性,表明广东番茄受到了ToCV的侵染。但ToCV广东番茄分离物的HSP70序列与国内外已报道的各分离物的同源性均低于82%,存在较大差异,其中与塞浦路斯tomato、约旦JU_20分离物的同源性最高,为81.8%。这是ToCV在广东发生的首次报道,也是该病毒HSP70基因序列存在显著差异分离物的首次发现。     

侵染番茄的番茄褪绿病毒山东泰安分离物的分子鉴定和序列分析

2012年秋季, 在山东泰安番茄主要种植区中采集到叶片褪绿, 叶脉颜色变深的疑似番茄褪绿病毒病和番茄侵染性褪绿病毒病的番茄样品。利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)的特异引物 ToCV1/ToCV2和番茄侵染性褪绿病毒(Tomato infectious chlorosis virus, TICV)的特异引物TICV1/TICV2分别对样品进行扩增, 最后仅得到利用引物 ToCV1/ToCV2 扩增的101 bp 的核苷酸序列, 对该核苷酸序列克隆并测序。序列比对表明, 山东泰安地区分离物与已登录的番茄褪绿病毒(ToCV)分离物相似性都在99%以上。随后, 对山东泰安种植区ToCV番茄分离物进行外壳蛋白(CP)及热激蛋白(HSP70)序列的扩增、克隆和测序(GenBank登录号KC812620/KC812625), 经NCBI BLAST比对发现, 目的序列与番茄褪绿病毒日本番茄分离物ToCV Japan/Tochigi (GenBank登录号AB513442/AB513443)相似性最高为99%, 同属于毛型病毒属的番茄褪绿病毒, 这是首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染。