凡纳滨对虾热休克蛋白70的原核高效表达

将凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）热休克蛋白70基因（heat shock protein 70，HSP70）克隆到原核表达载体pET-3c中，经酶切和DNA测序鉴定后，将重组质粒转入表达宿主BL21（DE3），在不同温度、时间下经IPTG诱导表达。收集菌液，进行SDS-PAGE和Western blot检测，并用软件Bandscan分析蛋白表达水平。结果表明，成功构建含凡纳滨对虾HSP70基因的重组表达载体pET-3c／HSP70，表达的目标蛋白相对分子量约为72kD，并能与小鼠抗人HSP70抗体特异性结合。37℃诱导5h目标蛋白表达量最高；但25℃诱导目标蛋白的可溶性比例达80％，目标蛋白占全菌总蛋白70％以上，均较37℃为高。     

热应激对剑尾鱼HSP70家族两成员基因表达的影响

采用RT-PCR方法扩增实验动物剑尾鱼（Xiphopohorus helleri）纯系RR-B的HSP70家族两个成员的eDNA片段，并将其克隆到PMD18-T载体中测序，将测序结果与GenBank中的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较。同时利用RT-PCR半定量方法研究热应激时两个成员在剑尾鱼组织中的表达。通过克隆获得了剑尾鱼的HSP70家族两个新成员的cDNA片段，两序列均包含HSP70家族的特征性签名序列和热休克蛋白的定位序列；通过对克隆片段与已发表的青锵（Oryzias latipes）等鱼类HSP70的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列同源性比较，发现核苷酸序列同源性较高，成员一和成员二分别为85％-89％和82％-99％；氨基酸序列同源性更高，成员一和成员二分别为97％-99％和93％-99％。一般条件下，两成员在剑尾鱼肝脏、脾脏、肾脏和心脏中不表达，但热应激能刺激成员一在剑尾鱼脾脏中表达，成员二在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中强烈表达，并可能在参与热应激保护方面起更大作用。     

不同地理种群栽培大豆HSP诱导合成的研究──Ⅳ．华北夏大豆与南方春大豆HSP恢复的比较研究

本文对华北夏大豆“齐黄１０号”和南方春大豆“苏８８—Ｍ１９”在４０℃热击２ｈｒ后，转到２５℃分别恢复处理２、４、６、８、１０ｈｒ。分析并比较了两者ＨＳＰ的变化。结果表明：随恢复期的延长，两种大豆ＨＳＰ的种类均在减少。累积量动态变化却有显著的区别，在恢复２ｈｒ时，“齐黄１０号”ＨＳＰ累积量急剧增加，尔后至１０ｈｒ时又逐渐减少；“苏８８—Ｍ１９”恢复２ｈｒ时，ＨＳＰ累积量大幅减少，尔后到１０ｈｒ时又逐渐增加。     

Effect of replacement of dietary fish meal with silkworm pupae meal on growth performance,body composition,intestinal protease activity and health status in juvenile Jian carp (Cyprinus carpio var. Jian)

This study investigated the effect of replacement of graded dietary fish meal (FM) protein (0, 50%, 60%, 70% and 80%) with silkworm pupae meal (SP) in juvenile Jian carp. Triplicate groups comprising 18 fish (15.96 ± 0.66 g) were fed one of five isonitrogenous and isocaloric diets (designated SP0, SP50, SP60, SP70 or SP80) for 8 weeks. The final body weight and specific growth rate of fish in the SP60, SP70 and SP80 groups were significantly lower than those for fish in the SP0 group (P < 0.05). The muscle protein content in the SP50 group was significantly higher than in the SP80 group (P < 0.05). With increasing FM replacement levels, the hepatic superoxide dismutase (SOD) activity decreased and the malondialdehyde (MDA) content increased among the groups, with the significant difference appeared in SP80 group. The gene expression level of heat shock protein 70 in the SP70 group was significantly higher than in the SP0 group (P < 0.05), while that in the SP80 group was significantly less than in the SP70 group (P < 0.05). Significantly decreased intestinal protease activity, increased serum ALT and AST activities, irregular‐shaped hepatocytes and intestinal microvilli were found in the SP80 group. The study demonstrates that it is practical to replace 50% of the Jian carp dietary FM protein with SP, higher SP levels are not recommended and that oxidation status of the SP should be carefully assessed.     

团头鲂 HSP70 cDNA 的克隆、序列分析以及热应激对其 mRNA 表达的影响

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆出团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏热休克蛋白70(HSP70)基因全长cDNA序列,共2 224 bp,包括135 bp5'非翻译区、1 932 bp阅读框以及157 bp 3'非翻泽区[不包括Poly(A)].阅读框共编码643个氨基酸,分子量计算值为70.53 kD,理论等电点为5.25.该HSP70基因在翻译区不含内含子,符合诱导型HSP70的特征.团头鲂HSP70氨基酸序列中含有HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等.同源性分析表明,团头鲂HSP70氨基酸序列与斑马鱼等脊椎动物的相似性高达84.0%以上,与无脊椎动物果蝇的相似性也高达73.4%.生物信息学分析显示,团头鲂HSPTO基因所编码的蛋白质以亲水性区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白;同时还含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥重要作用.该蛋白含有2个部分重叠的双向核定位序列,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域.应用实时定量PCR研究高温(34℃)应激对团头鲂HSP70 mRNA表达的影响.结果表明,在热应激过程巾肝脏HSP70 mRNA水平呈先升高后下降的变化趋势,说明该基因的表达受热应激调控,本实验克隆的序列为诱导型HSP70 cDNA.     

4种罗非鱼不同组织中HSP70基因对盐胁迫的响应

为了从分子水平评估莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正交子代(莫桑比克罗非鱼♀×荷那龙罗非鱼)和反交♂子代(荷那龙罗非鱼♀×莫桑比克罗非鱼)的耐盐性能,利♂用RT-PCR方法研究了盐胁迫下这4种罗非鱼不同组织中(鳃、肾、垂体和肌肉)热休克蛋白70(HSP70)基因的表达规律。结果表明:在盐度为22条件胁迫下4种罗非鱼各组织中HSP70表达水平总体呈现先增加后降低的规律,24 h时达最大值,48 h时下降至初始水平;盐度提高至35后HSP70的表达无显著变化。但不同种罗非鱼及不同组织之间也存在差异,反交子代鳃中HSP70在整个盐胁迫过程中都未上调表达;在盐度为22条件胁迫下,正反交子代肾中HSP70基因表达量比父母本肾中HSP70更早达到峰值;反交子代垂体中HSP70表达量在0~48 h内持续缓慢增加,48 h时达最大值;莫桑比克罗非鱼肌肉中HSP70基因在盐度22条件胁迫下表达量迅速升高,且维持较高水平直至盐度35条件胁迫之后。结果表明:HSP70表达水平的高低与罗非鱼的耐盐能力和应激程度密切相关,其中盐胁迫下肾中HSP70的表达规律与以上4种罗非鱼的耐盐能力之间相关性较强,可以作为评价这4种罗非鱼耐盐能力的潜在分子指标。     

The effects of dietary lipid levels on performance and heat‐shock protein response of juvenile white seabass,Atractoscion nobilis

A feeding trial was conducted to study the effect of dietary lipid on growth performance and heat‐shock protein (HSP70 and HSP60) response of white seabass (WSB), Atractoscion nobilis. Five diets were formulated to contain 440 g kg^?1 protein from 300 g kg^?1 fish meal, 240 g kg^?1 soybean meal and 100 g kg^?1 soy protein concentrate with different levels of lipid: 100, 120, 140, 160 or 180 g kg^?1. At the end of the trial, heat shock response based on HSP70 and HSP60 was measured in liver and white muscle from fish at ambient temperature and temperature shock conditions. Final weight and percent gain were significantly higher for fish fed the 100 g kg^?1 lipid diet than for fish fed the rest of the diets (P ≤ 0.05). Feed conversion ratio was lowest for fish fed the 100 g kg^?1 lipid diet. The HSP70 and HSP60 responses were positively correlated to dietary lipid levels following temperature shock. At ambient temperature, HSP60 and HSP70 responses in muscle and HSP60 response in liver increased with dietary lipid level. Temperature shock significantly increased the HSP response of fish in all treatments. Results of this study demonstrated that a moderate (110–120 g kg^?1) level of dietary lipids would be recommended for production diets but a higher dietary lipid level may be required for optimal stress tolerance.     

西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70cDNA的克隆、序列分析和组织分布

采用普通PCR和RACE技术克隆了西伯利亚鲟Acipenser baerii热休克蛋白HSP70 cDNA的全序列,该序列全长为2 343 bp,其中5＇非编码区为140 bp,3＇非编码区为256 bp,可读编码框（ORF）为1 947bp,编码为648个氨基酸。该氨基酸序列中含有HSP70家族的3个特征序列——IDLGTTYS、IFDLGGGTFD-VSIL和IVLVGGSTRIPKIQK,细胞质特征性保守序列为EEVD,C端重复序列为GGMP。该cDNA序列与其它生物的HSP70 cDNA序列一样具有很高的相似性。系统发育树显示,西伯利亚鲟与非洲爪蛙蟾Xenopus laevis、密西西比短吻鳄Alligator mississippiensis、美西螈Ambystoma mexicanum的亲缘关系较近。实时定量分析结果表明,水温为17.5℃时,西伯利亚鲟肝脏、鳃、脾脏、心脏、肌肉、中肠、性腺、脑8种组织中均有HSP70表达,其中HSP70在脾脏中的表达量最高,鳃中的次之,肝脏中最低（P〈0.05）。     

养殖密度对池塘工程化循环水养殖大口黑鲈抗氧化力、组织结构及应激基因表达的影响

为研究池塘工程化循环水养殖模式下养殖密度对大口黑鲈（应激基因表达的影响,以初始体重（4.50±0.23）g的大口黑鲈幼鱼为研究对象,设置3个养殖密度组,分别为0.2 kg/m³（SD1）、0.4 kg/m³（SD2）和0.6 kg/m³（SD3）,每个密度组设3个重复,实验周期为120 d,分别在实验的第30天、60天、90天和120天采集样本并分析。结果显示,实验结束时的最终密度分别为5.64 kg/m³（SD1）、8.79 kg/m³（SD2）和11.21 kg/m³（SD3）。养殖前90 d,肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力在各密度组间差异不显著（<0.05）;30 d和60 d时肝脏丙二醛（MDA）含量未受到养殖密度的影响（<0.05）;各密度组间肠道淀粉酶、脂肪酶活力没有显著差异（ mRNA相对表达水平在30 d和60 d没有显著差异（<0.05）,SD1组肝脏<0.05）;切片结果显示,3个密度组实验鱼肝脏和肠道结构正常,未受到严重损害,SD3组实验鱼肝脏细胞间空泡稍增多,肠道杯状细胞变小,数量减少。综上所述,在本实验条件下,养殖后期,养殖密度会对加州鲈生理状态产生影响,高密度应激会导致鱼体抗氧化以及免疫功能受到抑制,肝脏、肠道组织产生轻微损伤,0.2 kg/m³密度组大口黑鲈的生理状况最好。综合考虑,池塘工程化循环水养殖模式下大口黑鲈幼鱼的放养密度以0.2~0.4 kg/m³为宜。